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背景与目的:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,近年来其发病有明显年轻化的趋势,严重危害着女性的健康及生命。高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要危险因素,其中以HPV16和18型感染为主。长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)是一种长度为200-100000个核苷酸的非编码RNA,其功能复杂多样,可以在表观、转录及转录后水平对基因进行调控,在肿瘤的发生发展中具有重要的作用。1ncRNAHOTAIR(HOX transcript antisense RNA,HOX转录反义基因)是第一个被发现具有反式调控作用的IncRNA,在宫颈癌中呈显著高表达状态,本研究主要关注HOTAIR作为竞争性的内源RNA在HPV16型阳性宫颈癌细胞中,通过miR-214对细胞的增殖及凋亡的调控作用以及相关机制。方法:1.培养HPV阴性的C-33A细胞、HPV16型阳性的宫颈癌SiHa细胞、转化了 HPV16型E6和E7后永生化的宫颈上皮End1/E6E7细胞,采用实时荧光定量PCR法分别检测这三种细胞系中HPV16E7、HOTAIR、miR-214的表达水平。2.为了探究HOTAIR及miR-214对三种细胞系增殖和凋亡的影响,在C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中分别转染针对HOTAIR的小干扰RNA、miR-214 mimics以及阴性对照RNA,采用CCK8以及EdU掺入法检测细胞增殖的改变,细胞凋亡水平由流式细胞仪法进行检测。3.使用starbase v2.0预测HOTAIR与miR-214结合的位点,采用双荧光素酶报告系统实验验证结合位点。4.C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中分别敲降HOTAIR的表达,以及在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后,实时荧光定量法检测miR-214表达量的变化,另外在这三种细胞系中分别敲降和过表达HPV16E7以后检测HOTAIR及miR-214表达水平的变化。5.用 TargetScan7.2、PicTar、MirTarget2 分别预测 miR-214 的靶基因,并取三者结果的交集作为候选靶基因,并使用DAVID数据库对候选靶基因进行富集功能和通路分析,接着在C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR及过表达miR-214,并单独在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后检测β-catenin的mRNA及蛋白水平的变化。结果:1.实时荧光定量结果显示,与HPV阴性C-33A细胞相比,End1/E6E7及SiHa细胞中HPV16E7及HOTAIR呈显著高表达水平(P<0.01),而miR-214则呈显著低表达水平(P<0.001)。2.CCK8及EdU细胞增殖实验及凋亡流式检测结果显示,在End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR及过表达miR-214以后,细胞的增殖水平受到显著抑制(P<0.05),细胞凋亡水平明显上升(P<0.05),而C-33A细胞则几乎不受影响;但在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后,细胞增殖能力显著上调(P<0.01),凋亡水平明显下降(P<0.05)。3.starbase v2.0 预测出 HOTAIR 与 miR-214 的结合位点在 HOTAIR variant1上1794-1814bp的位置,接着采用双荧光素酶报告系统实验进行验证,在转染miR-214 mimics以后,荧光信号显著下降(P<0.01),证实HOTAIR上存在miR-214的结合位点。4.在End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR的表达以后,miR-214的表达显著上调(P<0.001),而C-33A细胞则无明显变化(P>0.05),而当在C-33A中过表达HOTAIR以后,miR-214的表达则显著下调(P<0.05);当在这三种细胞中敲降HPV16E7以后,End1/E6E7、SiHa细胞中HOTAIR的表达显著下调(P<0.05),与此同时miR-214的表达呈显著上调趋势(P<0.05),C-33A细胞中无明显变化(P>0.05);当在C-33A、End1/E6E7、SiHa细胞中过表HPV16E7后,三种细胞中HOTAIR的表达量均显著上升(P<0.05),同时miR-214表达量显著下降(P<0.05)。5.通过对miR-214的靶基因的预测以及相关生物信息学分析发现miR-214的靶基因显著富集于Wnt信号通路(P<0.001),其中β-catenin为miR-214的下游靶基因,在End1/E6E7、SiHa细胞中敲降HOTAIR及过表达miR-214以后,β-catenin的mRNA及蛋白水平均显著下调(P<0.05),在C-33A细胞中过表达HOTAIR以后,β-catenin的mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.05)。结论:HOTAIR在HPV16型阳性的宫颈癌中呈显著高表达水平,HOTAIR可以作为竞争性的内源RNA,通过竞争与miR-214结合,诱导上调β-catenin的表达,从而促进HPV16型阳性宫颈癌的发生和发展。HOTAIR可以作为HPV16型阳性宫颈癌的潜在治疗靶点以及预后评估的指标。