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研究背景死亡受体5（Death receptor5，DR5）是肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（TRAIL）的主要死亡受体之一，在TRAIL促进细胞凋亡的过程中发挥重要作用，是具有抗肿瘤应用前景的潜在的重要靶点之一。目前已有3种针对死亡受体5的靶向性抗肿瘤药物正处于II期临床试验之中。然而细胞表面的DR5表达量是影响及限制死亡受体5的靶向性抗肿瘤药物作用的一个重要因素。由于DR5只有在细胞表面才能发挥作用，因此凡是促进细胞表面DR5表达增加的因素均能提高细胞对TRAIL及抗DR5激动性抗体等药物诱导细胞凋亡的敏感性。目前，众多研究表明以DR5为靶点的抗肿瘤药物与众多化疗药物具有显著的协同抗肿瘤作用，并降低了化疗药物的使用剂量及其应用所带来的毒副作用。进一步探讨表明这些化疗药物多数能够影响细胞周期抑制细胞增殖，能有效增强细胞表达DR5。但是这些药物是否通过细胞周期影响DR5表达，两者之间即细胞周期与DR5表达是否具有密切联系还不清楚。本课题的研究将明确细胞周期与DR5表达的关联性，这一研究结果将对抗肿瘤治疗及以DR5为靶点的抗肿瘤药物应用提供临床指导，以及为阐明细胞周期影响DR5表达的分子机制提供理论指导，具有重要的理论和实际应用价值。同时本课题也纯化出可溶性sDR5，并通过杂交瘤技术制备出DR5单克隆抗体，探索了关于DR5单克隆制备的技术条件。目的：探究肿瘤细胞中细胞周期与DR5表达的相关性以及检测DR5的表达和分布，并探索纯化可溶性DR5蛋白（sDR5）和制备sDR5单克隆抗体的方法，同时探索了所制备抗体的特异性。方法：采用柱亲和层析法纯化sDR5；杂交瘤技术制备sDR5单克隆抗体；分子克隆技术转染外源基因，用过量的Thymidin处理EC109，进行双阻断同步化法得到不同周期时相的细胞，流式细胞术检测各个周期的DR5表达。免疫组化法、Western blot免疫印迹法、免疫荧光法，流式细胞术，RT-PCR技术检测各个周期DR5的表达和定位。采用携带目的基因DR5的pegfp-n2重组载体转染食管鳞癌细胞EC109中，观察细胞处于铺展或者非粘附状态下的DR5表达分布和定位情况。结果：纯化出纯度达到95%的sDR5蛋白；制备出活性良好的sDR5单克隆抗体；成功构建稳定的带有DR5的pegfp-n2的细胞株；细胞免疫组化和转染重组载体pegfp-n2+DR5外源基因至EC109细胞中观测DR5的表达，在铺展状态的细胞中，DR5主要分布在胞质和胞核周围；而在非粘附状态下，DR5主要分布在胞膜周围，且DR5在胞质中呈聚集状态。Thymidin双阻断同步化释放法，处理EC109细胞，分别在0h、3.5h、7.5h这三个不同时段获得G1（90.04%）、S期（97.86%）、G2期（87.17%）这三个不同细胞周期时相的细胞；根据以上方法所获得不同周期细胞来检测DR5的表达结果：流式细胞术检测EC109细胞不同细胞周期时相的DR5表达水平：normal组表达率为99.44%；G1期表达量为93.80%；S期的表达量为98.66%；G2期表达量为99.58%；免疫组化检测EC109细胞不同细胞周期时相的DR5表达（如图13），DR5在不同细胞周期时相的表达量G0/G1期<S期<G2/M期；western blot检测不同细胞周期时相的DR5表达结果（如图14），G1期低于S期，低于G2期，G2期表达最高；Realtime-PCR检测在不同细胞周期时相的DR5表达量（如图16），G0/G1和S期的DR5表达与G2/M期相比有统计学意义，有表达差异；我们采用2.5mM Thymidine双阻断同步化法处理EC109细胞，获得G0/G1期细胞；采用10uM LJK-11和20nM秋水仙素处理EC109细胞24h，获得G2/M期细胞，用一定浓度的具有促凋亡活性的抗DR5的抗体mDRA-6（本实验室前期制备）分别处理正常EC109细胞、G0/G1期细胞、G2/M期细胞，Annexin V和PI染色处理，流式细胞术检测细胞凋亡（如图17），G0/G1期与G2/M期相比，差异显著，P＜0.05，有统计学意义。结论：1、得到一株特异性良好以及活性良好的抗DR5单克隆抗体命名mGZA-1；2、细胞的铺展状态影响DR5的表达分布；3、DR5在EC109的细胞周期的不同时相表达有差异，说明DR5的表达与细胞周期之间有密切联系。