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本研究通过基因突变技术,改变人红细胞生成素的氨基酸序列,提高其分子中糖基化比例,达到延长蛋白在体内半衰期、提高生物活性的目的。主要研究内容包括基因定点突变、体内筛选并确定基因序列、构建工程细胞、确定培养和纯化工艺、开发体内活性测定方法、测定蛋白体内半衰期、目的蛋白进行理化分析和鉴定等。根据氨基酸序列分析结果,将人红细胞生成素(HuEPO)基因进行糖基化位点改造,使产生的蛋白分别增加1-4个糖基化位点。改造后的基因在CHO细胞中表达,测定表达蛋白在Balb/c小鼠体内网织红细胞增加情况。结果表明糖基化改造后的突变体在体内刺激网织红细胞增多作用比rHuEPO有不同程度的提高,在体内作用时间也有不同程度延长,作用时间与增加糖基化位点的数量正相关,增加3和4个位点的突变体在体内刺激网织红细胞增多的时间明显比rHuEPO和增加1-2个位点的突变体长。进一步对增加3个糖基化位点的突变体N3进行表达、纯化和鉴定。表达N3的重组CHO细胞在生物反应器中进行培养,通过控制温度、pH值、溶解氧、转数、通气流量、葡萄糖浓度和营养液流加速度等参数,使细胞密度达到5×106个/mL,连续表达28天,收获100L富含高糖基化红细胞生成素蛋白的收获液,表达量达到80mg/L以上。对收获液中的目的蛋白进行纯化,经离子交换层析、HPLC和分子筛层析,获得均一的高糖基化红细胞生成素蛋白,纯度大于98%,分子量47kDa,等电点2.9-3.8,唾液酸含量大于15 mol/molEPO蛋白；体内生物活性较rHuEPO显著提高；在大鼠体内的半衰期约为rHuEPO的3.3倍。本研究确定了一种与rHuEPO相比半衰期延长、生物活性提高的高糖基化红细胞生成素蛋白突变体,开发了目的蛋白的生产工艺,建立了相应的活性测定方法,并对目的蛋白进行了理化性质和体内外生物学鉴定,确定其为可适用于临床治疗的新型促红细胞生成药物。