论文部分内容阅读
认为缺血预处理的可能作用机制是通过提高HMGCR的酶活力，增加了细胞膜和线粒体膜胆固醇的含量，增强了细胞内源性的抵抗损伤能力，提高了细胞膜Na+—K+—ATP酶活力和减少了线粒体Cyto c释放，从而避免了细胞的凋亡和坏死，减轻了冷保存损伤。由此，我们设计了如下实验：我们先对比大鼠正常供肝、冷保存供肝以及缺血预处理过的冷保存供肝的HMGCR的酶活力、细胞膜和线粒体膜胆固醇的含量、细胞膜Na+—K+—ATP酶活力以及线粒体Cyto c等的差别，从中可以得出缺血预处理对以上指标的影响，然后我们再用含有不同浓度HMGCR酶抑制剂—阿托伐他汀的UW液灌注和保存供肝，以抑制HMGCR酶的活力，然后监测以上指标的变化。最后我们通过肝组织学检查和组织TUNEL测定，进一步验证以上结果。以此验证我们推断的缺血预处理保护机制的可能通路。
本课题主要包括两部分，具体内容如下：
第一部分供肝耐受热缺血和冷保损伤安全时限的临床研究
资料与方法：
本研究回顾性分析178例无心跳供体成人肝移植病例，对无心跳供体供肝在常见热缺血时间条件下耐受冷保存损伤的安全时限以及在常见冷保存时间的条件下耐受热缺血损伤的安全时限作一探讨。研究分两部分进行：
1.回顾性分析178例受体中142例供肝冷保存时间≤12h的病例的病历资料，根据热缺血时间的差别分为3组：Ⅰ组为5min之内，43例；Ⅱ组为5～10min，77例；Ⅲ组为10～15min，22例。比较3组间肝移植术后谷丙转氨酶峰值、原发性移植肝无功能、急性排斥反应、胆道并发症、血管并发症、感染，以及移植肝存活和受体存活的差异。
2.回顾性分析178例受体中154例供肝热缺血时间≤10min的病例的病历资料，根据冷保存时间不同分为3组：A组：8h之内，58例；B组：8～12h，62例；C组：12～16h，34例。比较3组间肝移植术后谷丙转氨酶峰值、原发性移植肝无功能、急性排斥反应、胆道并发症、血管并发症、感染，以及移植肝存活和受体存活的差异。
结果：
1.3组患者术后均未发生原发性移植肝无功能。随访时间8～32个月。Ⅱ组术后ALT峰值及感染发生率显著高于Ⅰ组；而Ⅲ组术后ALT峰值、胆道并发症发生率、血管并发症发生率及感染发生率均显著升高，而移植肝存活率及受体存活率均降低，与Ⅰ组相比差异均有统计学意义。
2.3组病人术后均未发生原发性移植肝无功能。随访时间8～32个月，B组病人术后仅ALT值高于A组；而C组病人术后ALT值、胆道并发症、感染、移植肝存活率及受体存活率与A组相比差异均有统计学意义。
结论：
冷保存时间在12h之内的无心跳供肝能耐受热缺血的安全时限为10min；同样，热缺血时间在10min之内的无心跳供体供肝能够耐受12h的冷保存损伤，超过此时限，肝移植术后肝功能恢复延迟，肝移植术后胆道并发症和感染的发生率显著升高，移植肝存活率和受体存活率显著降低。
第二部分缺血预处理减轻大鼠供肝冷保存操作的机制的实验研究
材料与方法：
一.大鼠供肝缺血预处理模型建立及实验分组
模型建立：麻醉成功后将大鼠固定于特制手术台上，四肢固定，沿腹中线切开进腹后先分离大鼠肝脏周围韧带，随后分离肝门部的肝动脉、门静脉和胆总管，进行缺血预处理时给予无损伤血管钳阻断肝动脉和门静脉，而不阻断胆总管。缺血预处理方式是先给予10min的肝门部的肝动脉和门静脉阻断，随后松开无损伤血管钳复流10min，最后行腹腔动脉灌注。灌注完毕后完整切下大鼠肝脏给予相应的处理。
试验分组：25只大鼠随机分为5组，每组5只。第一组为对照组：正常大鼠肝脏，4℃UW液灌注。第二组为冷保存组：灌注后冷保存8h。第三组为缺血预处理组：先给予缺血预处理，灌注后冷保存8h。第四组为阿托伐他汀30μM处理组：先给予缺血预处理，用终浓度为30μM的阿托伐他汀UW液灌注后再放入含30μM的阿托伐他汀UW液中4℃冷保存8h。第五组为阿托伐他汀100μM处理组：先给予缺血预处理，用终浓度为100μM的阿托伐他汀UW液灌注后再放入含100μM的阿托伐他汀UW液中4℃冷保存8h。
二.供肝HMG—CoA还原酶活力测定
—80℃冰箱取出按组分装的大鼠肝脏，4℃融化，根据Parker的方法制备HMGCR微粒体，制备好的HMGCR微粒体仍按组分装，所有操作均在冰上进行。采用购自碧云天公司的试剂盒按Bradford法测定各组HMGCR微粒体的蛋白浓度。取上述含HMGCR微粒体的重悬液，采用NADPH标准曲线测定HMGCR酶活性，HMGCR酶单位活性定义为在37℃、每mg蛋白提取液中每min氧化1.0μmol NADPH的所需HMGCR量。取分装的上清，采用Western Blotting方法测定HMGCR蛋白表达。
三.供肝肝细胞质膜胆固醇含量和Na+—K+—ATP酶活力测定
取大鼠肝组织约250 mg左右制成细胞质膜混悬液。采用酶法测定细胞质膜混悬液的胆固醇含量。采用无机磷测定法测定细胞质膜混悬液的磷脂含量。采用无机磷测定法测定细胞质膜混悬液Na+—K+—ATPase酶活力。
四.供肝肝细胞线粒体胆固醇含量和细胞色素C的测定
取大鼠肝组织约150 mg左右提取大鼠肝组织线粒体。采用购自碧云天公司的试剂盒按Bradford法测定线粒体的蛋白浓度。采用酶法测定线粒体的胆固醇含量。采用无机磷测定法测定线粒体的磷脂含量。采用无机磷测定法测定细胞质膜混悬液Na+—K+—ATPase酶活力。最后行大鼠肝组织线粒体和胞浆Cyto c Western Blotting测定。
五.供肝肝细胞调亡和坏死病理检查
取大鼠肝组织制作石蜡切片并进行HE染色制成玻片。由病理科医生进行组织学光镜检查，根据Suzuki标准进行评分评价肝脏的冷保存损伤的严重程度。石蜡切片进行组织TENEL测定。
结果：
一.动物模型建立及随机分组结果
建立了稳定可靠的大鼠冷保存供肝缺血预处理模型，并利用此模型进行实验分组，取得大鼠肝脏标本进行相应处理。
二.供肝HMG—CoA还原酶活力测定结果
供肝经过8h冷保存后HMGCR活性明显下降，给予缺血预处理后再给予冷保存，则HMGCR活性则明显升高；给予缺血预处理同时给予HMGCR抑制剂阿托伐他汀则HMGCR活性则受到明显抑制，并随着阿托伐他汀浓度的增加而抑制效应更为明显。冷保存8h后HMGCR的蛋白表达明显下降，给予缺血预处理后HMGCR的蛋白表达则明显上升；而给予缺血预处理的同时给予阿托伐他汀抑制HMGCR的活力，对HMGCR的蛋白表达略有影响。
三.供肝肝细胞质膜胆固醇含量和Na+—K+—ATP酶活力测定结果
大鼠供肝给予8h冷保存后较正常供肝相比，细胞质膜磷脂并无明显变化，而质膜胆固醇含量和Na+—K+—ATPase酶活力则明显下降。当给予缺血预处理后，大鼠供肝细胞质膜胆固醇含量和Na+—K+—ATPase酶活力较单纯冷保存相比有了明显的升高，而细胞质膜磷脂无明显变化。当缺血预处理的同时再给予HMGCR抑制剂阿托伐他汀，则8h冷保存后大鼠供肝细胞质膜胆固醇含量和Na+—K+—ATPase酶活力较单纯缺血预处理加冷保存组相比明显下降。
四.供肝肝细胞线粒体胆固醇含量和细胞色素C的测定结果
大鼠供肝经8h冷保存后线粒体胆固醇较正常大鼠肝脏线粒体胆固醇相比明显下降而磷脂并无明显的变化。给予缺血预处理后再给予8h冷保存后，胆固醇的含量较单纯8h冷保存有了明显的升高，但磷脂同样无明显的变化。如给予缺血预处理及同时给予阿托伐他汀抑制HMGCR活性，则线粒体的胆固醇再次出现明显下降。同时大鼠肝组织线粒体和胞浆的Cytoc呈现出同样的变化规律。即冷保存8h后Cytoc的释放同正常肝组织线粒体相比有了明显的升高，而给予缺血预处理后，Cytoc的释放则明显减少。给予缺血预处理同时抑制HMGCR活性则Cytoc的释放再次增加。
五.供肝肝细胞调亡和坏死病理检查结果
大鼠供肝冷保存8h后，同对照未保存供肝相比，无论是从光镜的病理评价还是从凋亡的改变来看，都存在明显的损伤。在冷保存前给予供肝缺血预处理则明显改善了供肝的损伤。如给予抑制HMGCR活性，即使给予供肝缺血预处理，仍出现明显的供肝损伤，并随HMGCR抑制剂浓度的增加而增加。
结论：
1.缺血预处理可以明显提高HMGCR活力，而阿托伐他汀则可消除缺血预处理升高HMGCR活性的作用；缺血预处理升高HMGCR活力的机制是增加HMGCR蛋白的表达。
2.冷保存损伤可致细胞质膜胆固醇含量下降和Na+—K+—ATPase酶活力的损害，而缺血预处理可以明显改善细胞质膜的Na+—K+—ATPase酶活力和升高细胞质膜胆固醇。降低细胞质膜的胆固醇的合成，则Na+—K+—ATPase酶活力也明显下降。
3.冷保存损伤可以致线粒体胆固醇含量下降和Cytoc的释放增加，而缺血预处理可以明显升高线粒体胆固醇含量而降低Cytoc的释放。线粒体胆固醇的变化与Cytoc的释放变化呈一致性，即线粒体胆固醇的增加则Cytoc的释放减少，线粒体胆固醇的减少则Cytoc的释放增加。
4.缺血预处理可以明显提高供肝质量，但其效应可以被HMGCR抑制剂所抑制，结合前面的研究可以认为质膜胆固醇是缺血预处理的关键效应机制。