论文部分内容阅读
目的:研究北豆根总碱对宫颈癌细胞Hela凋亡、细胞周期及侵袭性的影响,探讨北豆根总碱抗肿瘤作用机制,为抗肿瘤新药的研究和开发提供科学依据。方法:1采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度北豆根总碱(3.125、6.25、12.5、25、50μg/ml)处理不同时间(24、48和72小时)对Hela细胞增殖反应的抑制作用。2采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测不同浓度北豆根总碱(0、4、16、40μg/ml)作用48小时,对Hela细胞凋亡及周期变化的影响。3瑞氏-姬姆萨染色后显微镜观察北豆根总碱(0、40μg/ml)作用24小时后Hela细胞形态学变化。4采用Transwell小室法检测北豆根总碱(0、40μg/ml)作用24小时后对Hela细胞侵袭性的影响。5采用免疫印迹(Western blot)方法检测不同浓度北豆根总碱(0、4、16、40μg/ml)作用24小时后,Hela细胞中磷酸化ERK(p-ERK)、ERK、C-myc、CyclinD1的表达变化。6采用逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)半定量检测北豆根总碱(0、4、16、40μg/ml)作用24小时,Hela细胞抗凋亡基因bcl-2、促凋亡基因bax、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达变化。7应用激光共聚焦显微镜(laser scanning microscope,LSM)观察北豆根总碱(0、40μg/ml)作用24小时后,Hela细胞内P-ERK、ERK、Bcl-2、Bax蛋白的表达变化。结果:1北豆根总碱对Hela细胞增殖有较强的抑制作用,随着北豆根总碱浓度及作用时间的增加,对细胞的抑制率升高。其中50μg/ml北豆根总碱作用72小时对细胞抑制率最高(85.37%);与对照组相比,不同浓度北豆根总碱对细胞增殖的抑制率均有显著性差异(p<0.05)。2北豆根总碱能明显诱导Hela细胞发生凋亡和细胞周期阻滞。随着北豆根总碱作用浓度的增大,细胞的凋亡率升高,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,对照组与试验组之间比较有显著性差异(p<0.05)。3北豆根总碱作用24小时后,Hela细胞形态呈现凋亡前期改变。4 Transwell小室侵袭实验结果显示,经北豆根总碱(0,40μg/ml)作用24小时后,穿膜细胞数较对照组显著减少,存在显著差异(p<0.05)。5 Western blot分析结果显示,经4、16、40μg/ml北豆根总碱处理24小时后,Hela细胞中磷酸化ERK、C-myc、CyclinD1表达水平与对照组细胞比较均有所下降,ERK表达无显著性变化。6半定量RT-PCR检测结果显示,经不同浓度北豆根总碱处理后,Hela细胞抗凋亡基因bcl-2、基质金属蛋白酶-9 MMP-9 mRNA表达水平逐渐降低,促凋亡基因bax mRNA表达水平逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(p<0.05),该现象随着浓度北豆根总碱浓度的升高而更加明显,呈明显的浓度依赖性。7 LSM荧光图像分析结果显示,北豆根总碱(40μg/ml)作用24小时后,Hela细胞内抗Bax蛋白抗染色的荧光强度较对照组明显增加,抗P-ERK、Bal-2抗体荧光强度较对照组明显降低,ERK抗体荧光强度较对照组无明显变化。结论:1北豆根总碱在一定浓度范围内,能抑制宫颈癌细胞Hela的增殖,具有明显的量效关系。2北豆根总碱可通过降低Hela细胞中磷酸化ERK(P-ERK)水平,抑制Hela细胞ERK1/2信号转导通路。3北豆根总碱通过抑制Hela细胞ERK1/2信号转导通路,减弱bcl-2,MMP-9 mRNA表达,增强bax mRNA表达,减弱Hela细胞中C-myc、Cyclin D1蛋白的表达,进而促进Hela细胞凋亡,抑制Hela细胞侵袭力,使细胞阻滞于G0/G1期。