研究背景和目的因外伤、疾病、衰老和先天畸形所造成的软组织缺损一直是整形外科学面临的常见问题。为解决上述问题,胶原注射、真皮移植、人工合成材料植入等软组织填充方法被广泛应用于临床。1889年,Vander Meulen首先报道了脂肪组织的自体移植,至今已有百余年的历史。自体脂肪移植具有的低免疫原性、供区低损伤、操作简便等优点使得这项技术自上世纪30年代起便被广泛应用于整形外科。尽管脂肪移植效果明显,但长期移植的效应难以控制,其高吸收率、低存活率、多并发症,限制了它在临床中的应用。游离脂肪移植物也面临着脂肪液化、移植物吸收、纤维组织替代等问题,它使得移植物随时间推移的最终保存量仅为最初体积的40-60%。研究发现,在移植早期,脂肪移植物缺乏有效的血液供应而处于急性缺血缺氧状态。在移植物与宿主建立充分的血供之前,脂肪组织只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应,这时中央部分的脂肪组织已经由于缺血缺氧时间过长,发生了坏死、液化。由此可见,在自体颗粒脂肪移植后的转归过程中,移植早期建立及时、充分的血供,移植物及时地再血管化是影响其成活体积的关键。因此,如何促进移植物在短时间内血管化以提高移植脂肪的存活率成为了当前研究的焦点。近年来随着人们对干细胞研究的不断深入,利用干细胞移植疗法来促进移植物的再血管化,为有效促进移植组织再血管化展示了美好的前景。Makoto等研究证明脂肪组织来源的干细胞(Adipose derived stem cells, ASCs)可促进大鼠后肢局部缺血模型的再血管化,缺血的肌肉组织含有自ASCs转化的血管内皮细胞。本课题组前期的研究发现,体外培养的人ASCs混合脂肪颗粒移植于裸鼠皮下,促进新生血管形成,显著提高脂肪移植物的存活率。然而,临床应用自体培养的ASCs有其局限性,体外培养获取自体ASCs显然无法完全满足临床需要。体外扩增耗时长,至少需要2-3周的时间,这就意味者接受脂肪移植的患者需要二期手术。不仅如此,体外培养操作繁琐,易污染,安全性低,对设施及器材要求严格,费用较高,临床应用受限制。既然ASCs来源于脂肪中血管基质层细胞(stromal vascular fraction cells, SVFs),且SVFs可通过新鲜分离获得,那SVFs是否能替代ASCs成为促进游离移植脂肪早期血管化的种子细胞呢?2008年,日本学者Kotaro Yoshimura第一个报道了脂肪中SVFs辅助游离脂肪移植的临床应用,研究证实与单纯脂肪移植相比,SVFs辅助的脂肪移植能明显降低脂肪的纤维化、液化,能显著提高脂肪移植的细胞存活率。A. van Dijk等人发现将SVFs静脉注射入心肌梗死小鼠体内,可显著促进缺血心肌组织的再血管化。最近还有研究指出,SVFs可通过促进小鼠游离皮瓣再血管化来增进皮瓣的成活。SVFs在人体脂肪组织中储量巨大、方便获取,自体应用不存在免疫排斥的特性,从脂肪组织新鲜分离得到的SVFs中即含有足够数量的、具有生物学活性的自体ASCs。更重要的是,应用自体SVFs甫助脂肪移植,手术亦可一期完成,且无需体外培养,安全性高,更易于临床推广,这使得脂肪SVFs有望成为促进游离移植脂肪再血管化最有前景的种子细胞。目前为止,尽管SVFs甫助脂肪移植技术无论在实验室还是临床应用中均被证实可以有效地提高移植物的存活率。然而遗憾的是关于移植后脂肪组织存活的潜在机制尚缺乏令人信服的实验室证据。有几个问题有待于解决：(a) SVFs辅助脂肪移植较单纯脂肪移植相比脂肪细胞在移植过程中形态学发生怎样的动态变化?(b)SVFs辅助脂肪移植的脂肪细胞再生的机制及SVFs中启动移植后早期再血管化进程的最主要因素是什么?(c)SVFs辅助脂肪移植何种最佳细胞浓度才能更加促进移植脂肪的存活率?围绕这几个科学问题,本实验先是研究了单纯脂肪移植组织学的动态变化趋势,通过比较新鲜分离的自体SVFs辅助脂肪移植及单纯脂肪移植在不同时间点的移植效果,观察各时间点移植物湿重测量、HE染色切片分析,免疫组化、PPARγ荧光原位杂交、Western Blot及ELISA等技术来探讨自体SVFs促进脂肪移植物存活率的脂肪细胞再生及再血管化机制,这对于揭示SVF促进游离脂肪移植存活率的具体机制,推动干细胞疗法在脂肪移植中的应用意义重大,为临床应用提供实验依据。方法1、单纯游离脂肪移植的模型制备及脂肪移植物存活的评价。将0.5ml脂肪颗粒用16号针头,按照随机化原则注射于实验裸鼠腰背区皮下的2个受区,每个时间组共注射6只。分别于移植术后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7个时间点,观察以下几个指标：(1)移植物大体观；(2)湿重及湿重百分比；(3)HE染色切片；(4)免疫组化染色(S100,CD68)。2、SVFs辅助游离脂肪移植的模型制备及脂肪移植物存活的评价。将S、F两组移植物随机注入每只裸鼠背部皮下：S组：将数量为1×106/mlSVFs混悬液与0.3ml脂肪混合；F组将0.3mlDMEM完全培养基与0.3ml的脂肪颗粒均匀混合(阴性对照组)。分别于移植术后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7个时间点,观察以下几个指标：(1)移植物大体观；(2)湿重及湿重百分比；(3)HE染色切片；(4)免疫组化染色(S100,CD68);(5)统计学分析。3、SVFs辅助游离脂肪移植再血管化的检测分别于移植术后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7个时间点,检测S组及F组以下指标：(1)HE染色切片分析；(2)免疫组化染色(CD31、CD34)及系统软件分析血管密度及趋势；(3)Western Blot检测肝细胞生长因子(HGF);(4)ELISA检测血管内皮生长因子(VEGF)、和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)血管相关因子；(5)统计学分析。4、SVFs辅助游离脂肪移植的脂肪细胞再生的检测分别于移植术后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7个时间点,检测S组及F组以下指标：(1)HE染色切片分析；(2)免疫组化染色(CD68、S100)及系统软件分析新生脂肪细胞及成熟脂肪细胞存活率及趋势；(3)PPARγ荧光原位杂交检测来源于人的脂肪因子的表达及分化情况；(4)统计学分析。5、SVFs辅助游离脂肪移植的最佳浓度的检测将A、B、C、D四组移植物随机注入每只裸鼠背部皮下(n=6)：A组将数量约5×105/ml的SVFs混悬液,B组将数量为1×106/mlSVFs混悬液,C组将数量为2×106/mlSVFs混悬液分别与O.3ml脂肪混合；D组将0.3mlDMEM完全培养基与0.3ml的脂肪颗粒均匀混合(阴性对照组)。移植术后3个月取材对移植脂肪组织进行观察,指标有：(1)脂肪组织湿重测定；(2)HE切片染色；(3)Gunderson"点计数”法定量评价移植物纤维坏死及脂肪细胞存活情况；(4)移植物中毛细血管数目；(5)统计学分析。6.统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS13.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验：不同时间点的差异采用协方差分析；完全随机设计资料的多样本均数比较采用LSD检验。结果1、术后不同时间点单纯脂肪移植物存活率：1天(82.98±3.01)%,4天(81.91±2.931)%,7天(82.27±1.74)%,14天(82.98±1.90)%,30天(48.58±3.13)%,60天(47.16±2.49)%,90天(47.52±1.74)%。移植后的脂肪在两周内湿重变化不显著,14周至30天湿重显著性减少,减少约为第一天的一半,随后湿重减少较为缓慢,90天后湿重保持稳定约有47%组织存活。HE观察：移植早期组织中央部出现坏死形成大量空泡,脂肪细胞间隙出现增宽,间质组织明显长入；第7天移出现了少量新生的脂肪细胞,随后新生的脂肪细胞增多并趋向成熟,移植晚期分化成为成熟脂肪细胞且数量逐渐减少,纤维化明显,部分区域组织结构与正常的脂肪组织基本相同。免疫组化染色S-100蛋白阳性及小细胞CD68阴性均证实新生的小细胞是脂肪细胞。2、SVFs辅助脂肪移植后湿重百分比：1天(83.33±2.49)%,4天(84.04±2.93)%,7天(84.40±2.58)%,14天(87.23±3.01)%,30天(56.03±2.20)%,60天(54.61±1.74)%,90天(56.38±3.50)%,两组采用配对t检验比较除第1、4、7天与对照组没有显著性差异外(P>0.05),余时间组均显著高于对照组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同时间点SVFs组协方差分析示：不同天数之间比较有统计学差异(P<0.05)。SVFs辅助脂肪移植较对照组而言14天移植物存活率稍有抬高,30天存活率减少约为第一天的27%,90天约有56%组织存活。HE观察：早期SVFs组移植物中央区出现空泡、囊腔样改变较对照组少,间质组织长入明显,SVFs组移植后第7天出现了新生的多房的脂肪细胞且较对照组多,同时伴随成熟程度不一的多种形态的新生脂肪细胞存在,晚期分化为新生的成熟脂肪细胞较对照组多。免疫组化染色：新生细胞S-100蛋白阳性及CD68表达阴性。3、①HE组织学观察SVFs组于移植后第4天包膜出现新生血管较对照组早(第7天),血管密度较对照组大,新生血管逐渐从移植物包膜向中央长入。②ELISA检测不同时间点血管因子VEGF、bFGF表达量SVFs在移植后早中期第4天、7天、14天表达量均较对照组高,且第7天达到峰值,两组采用配对t检验比较差异有统计学意义(P<0.05),30天后的时间点表达降低,两组没有显著性差异(P>0.05)；不同时间点SVFs组协方差分析示天数之间比较有统计学差异(P<0.05)。③estern Blot检测不同时间点HGF血管化细胞因子：除移植后第30天两组没有显著性差异外,各时间点SVFs表达量均较对照组高,有显著性差异(P<0.05),不同时间点SVFs组协方差分析示天数之间比较有统计学差异(P<0.05)。④免疫组化染色：造血干细胞系的CD34早期表达较少,第7天开始增多,14天-30天达到高峰,随后逐渐减少,SVFs组表达高于对照组,形态上从小的间质样细胞分化为成熟的管腔样血管结构。⑤免疫组化系统软件分析CD31阳性血管的密度：SVFs组第4天密度缓慢增高(对照组为第7天),到30天达到高峰,随后趋于平稳。SVFs血管密度均高于对照组,两组采用配对t检验比较于7、14、30天两组血管密度差异有统计学意义(P<0.05),余时间组无差异(P>0.05)。不同时间点SVFs组协方差分析示天数之间比较有统计学差异(P<0.05)。4、①移植术后HE染色：观察单纯脂肪移植组新生脂肪细胞的动态演变过程：由原始间叶组织衍变成梭形脂肪细胞再演变成前脂肪细胞、圆形脂肪细胞、多泡性脂肪细胞、单泡性印戒样细胞、和成熟脂肪细胞。而SVFs组除了具有对照组特点外在移植早期就以不同分化状态的多种细胞形式出现,且多于对照组。②免疫组化染色系统软件分析S100阳性的成熟脂肪细胞及新生脂肪细胞不同时间点密度变化：新生脂肪细胞移植后7天开始增多,60天达到高峰,随后密度稳定,SVFs组高于对照组；成熟脂肪细胞于移植后密度逐渐减少,14-30天减少到最高值,60天后较为平稳,SVFs组高于对照组。二者采用配对t检验比较分别于14天、30天、60天两组差异有统计学意义(P<0.05),余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。不同时间点SVFs组协方差分析示天数之间比较有统计学差异(P<0.05)。③免疫组化染色CD68早期表达较少,晚期逐渐增多,集中在脂肪细胞间隙内,新生脂肪细胞区域表达大部分阴性。④PARy荧光原位杂交证实新生脂肪细胞核及胞浆有点状绿色荧光表达,证实了新生的脂肪细胞大部分是来源于人并具有分化能力,进一步排除了巨噬细胞的肯能。5.不同浓度组比较：①湿重：A组(60.00±6.32)mg,B组(81.67±7.53)mg, C组(66.70±8.16)mg,D组(45.02±10.49)mg,B组脂肪存活率均高于A、C、D组(P<0.05),A、C两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。②血管密度：A、C、B组血管密度均高于组D,且B组明显高于其他三组(P<0.05),A、C两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。③点计数：B组存活脂肪细胞计数均高于A、C、D组(P<0.05),纤维组织计数均低于D组(P<0.05),A、C两组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)讨论目前,自体脂肪颗粒移植后的吸收率,国内外的报道尚不一致,脂肪移植后的吸收率从5%-100%相差甚远,多数学者认为,术后1年的吸收率约为50%。一般来说,脂肪体积在移植后的1个月内吸收最快,2-6个月后开始趋于稳定,1年后几乎不再吸收。近几年,人们对脂肪移植的研究更多是关注于临床短期或长期的移植效果及再血管化的效应,尚缺乏一个对移植后脂肪细胞动态变化过程观察的实验研究。本实验研究证实单纯脂肪移植后的脂肪存活率在2周至1个月显著性减少,3个月后基本保持稳定。在移植早期出现了新生的脂肪细胞存在,随着时间推移新生脂肪细胞增多且趋向成熟,最终以成熟脂肪细胞存活下来。应用自脂肪组织新鲜分离的SVFs复合脂肪颗粒为制备软组织修复材料提供了一种新的方法,它较ASCs而言更具有成活率高、吸收率低、使用安全、制备简便和价格低廉的优点,且不需要长期体外培养,减少了污染,可直接应用于自体移植,能够向成骨、成软骨、成脂肪、成血管和神经等方向分化,且具有明显的促再血管化及提高移植物存活率效应。为了证实SVFs复合脂肪移植与单纯脂肪移植相比在形态学及组织学动态演变过程中的差别,本实验比较了不同时间点两组的大体观及组织学并证实了SVFs辅助脂肪移植比单纯脂肪移植更能提高脂肪移植的存活率,明显降低脂肪的纤维化、液化,早期出现了较单纯脂肪组而言更多的新生多房脂肪细胞,并伴随成熟程度不一的多种形态的新生脂肪细胞存在,揭示了脂肪移植物脂肪细胞再生的潜在机制。正如众所周知,临床上进行任何移植都必须考虑到血液供应,移植物只有获得了充分的血供才能生存。但早期细胞的营养还主要依靠细胞间液的渗透,但这种渗透也最多能营养到距离毛细血管150μm的脂肪细胞,而超过这个距离的细胞无法获得支持细胞代谢所必须的营养。这也解释了为何单纯脂肪细胞游离移植存活率不高的原因。因此如何能快速重建良好的血运,是脂肪移植成功与否的关键。SVFs所具有的促血管化作用便体现出了极大的应用潜力,但是SVFs通过何种机制来促进游离脂肪移植后血运重建目前仍不清楚。本实验证实了SVFs辅助脂肪移植的再血管化最早发生于移植后的第4天,较单纯脂肪移植要早,血管密度较单纯脂肪组多。SVFs组早期VEGF、HGF和bFGF血管相关因子的表达均较单纯脂肪组高,这说明SVFs在移植的早期处于缺氧状态下,通过旁分泌机制有效的分泌促血管因子,从而加速新生血管从移植物的周围受区以“出芽”方式形成,提高了移植物的存活率。自体脂肪移植的最大挑战在于维持其长久的效果,因此对于脂肪移植后脂肪细胞到底是以何种方式存活下来的探讨成为研究的热点,关于单纯游离移植脂肪的存活机制,存在两种学术观点：一种是宿主取代论,即宿主的巨噬细胞吞噬坏死脂肪细胞释放的脂滴后,变为成熟脂肪细胞,取代原有的移植细胞；一种为细胞存活论,即宿主的巨噬细胞只是清除部分坏死脂肪细胞释放的脂滴,并不能形成脂肪细胞取代移植的脂肪组织,部分宿主原有的脂肪细胞度过最初的缺血缺氧期后,长期存活下来。本实验证实了SVFs脂肪移植比单纯脂肪组更能促进脂肪细胞细胞的再生。成熟脂肪细胞及新生的脂肪细胞存活率均高于对照组。单纯脂肪移植新生脂肪细胞动态演变过程是由梭形脂肪细胞再演变成圆形脂肪细胞、单泡性印戒样细胞和成熟脂肪细胞。而SVFs组则是以不同分化状态的细胞存活,新生的脂肪细胞大部分是来源于人SVFs中的间质细胞分化及去分化脂肪细胞的再分化,少部分是由原有的脂肪细胞成脂再分化而来,揭示了脂肪细胞再生的潜在机制。国外的研究者提出在SVFs辅助脂肪移植中通常采用的SVFs与脂肪颗粒的体积比是1：1,即可取得较为理想的脂肪移植效果,但按1：1体积比进行移植并不客观准确,且胶原消化过程过于繁琐,因此如何客观准确的评估移植比例,对于脂肪移植是至关重要的。有研究称每克皮下脂肪大约可获取0.5×106～2.0×106个有活力的SVFs.在我们的研究中已证实1ml人脂肪组织中可提取出0.9×106～3.0×106个SVFs,故单位体积的待移植脂肪可混合更多数量的SVFs。我们认为SVFs的浓度是影响移植效果的重要原因之一,利用浓度比进行移植更为精确和客观,而今关于SVFs辅助脂肪移植的有效浓度尚缺乏准确性的报道,如果加入血管基质成分过多,会使得术后脂肪组织的体积无法预测；反之如果加入血管基质成分太少,移植脂肪组织的体积达不到预期效果。故本实验中研究促进脂肪移植的最佳SVFs浓度,发现1×106/ml的SVFs浓度更能促进移植脂肪组织存活率及新生血管生成,为临床软组织缺损修复提供了实验依据。结论1、从单纯脂肪及SVFs辅助脂肪移植后到脂肪成活的整个过程中存在着脂肪细胞动态变化的规律,移植物体积的变化伴随着组织学的变化。2、SVFs辅助脂肪移植比单纯脂肪移植更能提高脂肪移植再血管化及脂肪细胞再生效果,更能提高移植物的存活率。3、SVFs辅助脂肪移植的再血管化发生较单纯脂肪移植早,自体SVFs通过旁分泌机制有效的分泌促血管因子以提高脂肪移植物再血管化。4、SVFs甫助脂肪移植早期出现脂肪细胞再生,并伴随分化成熟程度不一的多种形态的新生脂肪细胞存在,最终以成熟的脂肪细胞而存活下来,揭示了细胞存活论及去分化-再分化机制是SVFs辅助脂肪移植物脂肪细胞再生的潜在机制。5、1×106/ml数量级的SVFs移植脂肪的存活率最高,更适合用于脂肪移植,具有广阔的临床应用前景。