【摘 要】
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光照作为授时因子,能够牵引机体内部的生物钟,影响昼夜节律的周期和相位。而光牵引的具体机制较为复杂,有待深入研究。在斑马鱼中,个体、组织甚至细胞都具有光敏感性,光照通过Tef蛋白（PAR家族因子）绑定D-box,激活核心生物钟基因的表达,而Nfil3（E4bp4）蛋白作为D-box的抑制因子,在生物钟环路中起到不可或缺的作用。在斑马鱼中nfil3有7个同源基因,解析斑马鱼中nfil3基因的转录调控机
【基金项目】
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国家自然科学基金中德合作项目,31961133026,斑马鱼胚胎生物钟分子遗传和基因组机制的研究
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光照作为授时因子,能够牵引机体内部的生物钟,影响昼夜节律的周期和相位。而光牵引的具体机制较为复杂,有待深入研究。在斑马鱼中,个体、组织甚至细胞都具有光敏感性,光照通过Tef蛋白（PAR家族因子）绑定D-box,激活核心生物钟基因的表达,而Nfil3（E4bp4）蛋白作为D-box的抑制因子,在生物钟环路中起到不可或缺的作用。在斑马鱼中nfil3有7个同源基因,解析斑马鱼中nfil3基因的转录调控机制将有助于我们解析光牵引生物钟的机制。本研究探究了光照对斑马鱼的行为节律及光敏感的生物钟基因的影响。在DD恒暗条件下CT14（11:00 PM）给予野生型（WT）斑马鱼3 h光刺激,行为实验结果显示斑马鱼的行为节律的相位明显提前,周期延长;RT-qPCR结果显示per2和cry1aa的表达量显著上调,表明这两个生物钟基因的上调可能与光照牵引斑马鱼的行为节律的相位有关。为了研究Nfi13转录因子和PAR家族因子在光牵引中的作用,本研究利用CRISPR-Cas9和Gateway技术分别建立了三种nfil3基因包括nfil3-1a、nfil3-1b.1和nfil3-3a的突变体和转基因过表达鱼系,并且通过检验光处理后per2和cry1aa在突变体背景下的表达量,发现nfil3-1a基因可能在光牵引中的作用最大,进而选择nfil3-1a基因进行以下实验。RT-qPCR结果显示nfil3-1a基因在斑马鱼早期发育中转录振荡,在CT16表达达到峰值;双荧光素酶报告实验和ChIP实验结果显示Clock1a和Bmal1b等蛋白通过E-box和RORE元件调控nfil3-1a基因的表达。此外,光刺激能够诱导nfil3-1a基因的表达,双荧光素酶报告实验和ChIP实验结果显示Tefa和Nfil3-2b等蛋白通过D-box元件调控nfil3-1a基因的表达。因此,nfil3-1a基因受光照和生物钟调控。利用nfil3-1a-/-和Tg（hsp70l:nfil-1a;CG2）过表达鱼系进行行为实验显示,与WT斑马鱼相比,在LD（光暗循环）条件下,nfil3-1a-/-斑马鱼活动量明显增加;在LL（恒亮）条件下,nfil3-1a-/-斑马鱼的行为节律的相位明显延迟。另外,Tg（hsp70l:nfil3-1a;CG2）过表达斑马鱼在DD（恒暗）条件下表现出行为节律的相位提前,在LL（恒亮）条件下表现出行为节律的相位延迟,进一步表明Nfil3-1a在斑马鱼生物钟中的作用。为了进一步研究Nfil3-1a在光牵引中的作用,在DD（恒暗）条件下,分别在CT16（1:00 AM）和CT22（7:00 AM）给予1h光刺激能够引起斑马鱼的行为节律的相位延迟和提前,其中nfil3-1a-/-中相位变化比WT斑马鱼更明显,利用Tg（per3-luc）;nfil3-1a-/-斑马鱼检测眼睛组织中per3-luc的近日节律进一步验证了行为结果的可靠性。基于RNA-Seq转录组分析发现给予光刺激后导致nfil3-1a-/-中行为节律的相位延迟和提前更明显可能是由于per2、per3和bhlhe41等基因在不同时间点的差异表达。因此,本研究将继续研究Nfil3-1a蛋白调控下游关键靶基因的分子机制。综上所述,本研究表明光诱导的nfil3-1a基因可能通过调控per2、per3和cry1aa等基因在光牵引中发挥作用,提供了对光牵引潜在的机制的认识。
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