黄颡鱼卵致病性绵霉的分离鉴定与感染机制的研究

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黄颡鱼是一种名优淡水经济鱼类,在我国广泛养殖且具有很大的市场前景[1、2]。然而,水霉病常引起人工孵化过程中大量的黄颡鱼受精卵死亡,导致黄颡鱼的苗种供应紧缺。因此,开展水霉病的研究具有重要的生产性意义。2011年6月份,湖北省仙桃市某孵化场的黄颡鱼卵由于感染水霉病,给该场带来了严重的经济损失。鉴此,本论文对该水霉病进行了病原的分离和鉴定,测定了中草药和防霉剂对其的最小抑菌浓度,并初步研究了黄颡鱼卵水霉病的感染机制。本文有如下主要研究结果:1菌株YC的分离鉴定从患水霉病的黄颡鱼卵上分离到8株丝状真菌,经人工感染证实菌株YC对黄颡鱼卵具有致病性,并通过态学特征和ITSrDNA序列分析对致病菌株进行鉴定。结果表明,菌株YC的孢子囊多呈圆筒形、棍棒形或穗状,孢子发育成熟后不断从孢子囊顶端释放出来,成团聚集在孢子囊口,并经过一个时期的静休后,成团脱落或直接分散在水中游动;次生孢子囊具有典型的侧生现象;藏卵器呈球形或梨形,大多与雄器异枝,少数与雄器同枝,含115个卵孢子;成熟卵孢子中生或亚中生,偏生一个大油球。其ITSrDNA序列与GenBank中绵霉属自然聚类,且与异丝绵霉(Achlyaklebsiana)菌株CBS101.49(GenBank登录号:AF119579)的亲缘关系最近。结合以上形态特征与系统发育鉴定的结果,判定菌株YC为异丝绵霉(Achlyaklebsiana)。2菌株YC的简易保藏为有效保藏异丝绵霉YC,本文建立了一种简易高效的保藏方法:先将诱生菌丝的油菜籽放入灭菌的5mL离心管,接着在离心管中加入4.8mL的无菌蒸馏水,或加入3.8mL的无菌蒸馏水和1mL的液体沙氏培养基,最后置于4°C保藏。实验结果表明,该方法可以有效保藏异丝绵霉YC至少1年以上,且复苏率为100%。该保藏方法与传代培养保藏法相比保藏期更长,与冷冻干燥保藏法相比操作更简易,成本更低,占用空间少,是一种简易高效的保藏致病性水霉病病原的的方法。3菌株YC对黄颡鱼卵感染机制的初步研究通过接种不同浓度水霉菌孢子悬液,研究水霉孢子浓度与鱼卵水霉病爆发的关系,同时研究了水温与水霉病爆发的关系;并进一步通过人工感染,观察了异丝绵霉YC对黄颡鱼卵的感染过程。实验结果表明:1)鱼卵水霉病的感染是通过水体中的孢子感染的,并可在鱼卵之间传播;2)本试验条件下,孵化刚开始,就有孢子开始附着鱼卵;3)附着在死卵的孢子快速萌发,形成太阳籽,并大约经过20h第一次开始释放孢子;4)附着在活卵上的孢子只萌发出一个小芽,或极少数无序生长;5)当孵化水中有孢子游动时,可以观察到死卵周围的孢子浓度比活卵周围的孢子浓度高;6)在黄颡鱼卵孵化的48h内,水体中浓度与黄颡鱼卵水霉病发病率呈正相关关系,水霉病的感染率均随着孢子浓度的增加而增加,且各浓度组之间差异显著;7)在黄颡鱼卵孵化的48h后,孢子浓度不低于100个/mL的浓度组中的水霉病感染率随着时间的延长各处理组水霉病感染率差异不大,并在孵化后48-60h开始爆发水霉病,且起始孢子浓度越高,爆发越早。本试验首次研究了孢子浓度与水霉病爆发的关系,并观察了绵霉孢子的感染过程,为控制鱼卵水霉病的感染提供理论参考。4菌株YC的药敏特性采用倍比稀释法,测定了31种中草药和12种防霉剂对异丝绵霉YC的抑菌效果。实验结果表明,在中草药中,黄连对异丝绵霉YC的抑菌效果最好,其对菌株YC的MIC为256mg/L;在防霉剂中,防霉剂X的效果最好,其MIC为0.5mg/L。本结果为异丝绵霉引起的水霉病提供了参考性防治药物。
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