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目的:趋化因子是单链小分子蛋白质超家族,是一类使细胞发生趋化运动的细胞因子,趋化因子行使其功能由趋化因子受体介导。CXCL12属于趋化因子家族(过去又称SDF-1stromal cell-derived factor-1),由基质细胞分泌。CXCR4是一种趋化因子受体,在对卵巢癌的研究中,所观察的14个趋化因子受体只有CXCR4在卵巢癌细胞上表达。CXCR4是CXCL12的唯一生理性受体,CXCL12又是CXCR4的唯一生理性配体,两者之间有着非常高的亲和力,趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4所构成的CXCL12-CXCR4生物轴在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥着重要的作用。本课题组前期研究发现,正常卵巢上皮不表达CXCL12和CXCR4;卵巢癌组织高表达CXCR4;卵巢癌患者腹水和腹膜间皮细胞高表达CXCL12,因此,推测CXCL12-CXCR4生物轴在卵巢癌腹腔转移中发挥着极其重要的作用。本研究拟在体外实验水平探讨CXCR4表达变化对卵巢癌腹腔转移的影响。方法:1真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4的构建将CXCR4基因克隆通过PCR方法获得PCR产物。将空载体pReceiver-M02和PCR产物通过退火、酶切、连接等反应,构建真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4,并进行测序。使用Sequence3.0分析软件对测序结果与GeneBank中的数据进行分析。2稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定利用脂质体介导的转染方法,将真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4及空载体pReceiver-M02分别转染卵巢癌细胞SKOV3,经G418筛选获得了数个单细胞并将其扩大培养,所获得的细胞经RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法鉴定。3 CXCL12-CXCR4相互作用在体外实验水平对卵巢癌细胞生长及侵袭转移的影响将转染真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4、转染空载体pReceiver-M02及亲本卵巢癌细胞SKOV3进行体外培养。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,观察不同浓度CXCL12对三种细胞生长的影响以及CXCR4中和抗体与CXCR4拮抗剂AMD3100的抑制作用;以Transwell侵袭小室为模型,应用Matrigel探讨各种浓度梯度的CXCL12对三种细胞迁移、侵袭的影响以及CXCR4中和抗体与CXCR4拮抗剂AMD3100的抑制作用。结果:1目的基因CXCR4的PCR产物目的基因CXCR4通过PCR方法扩增得到一条大小为1059 bp的单一特异性条带,与CXCR4片段大小相符。2真核表达重组质粒的提取及测序真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4构建成功后,进行DNA测序,结果证实CXCR4基因克隆与空载体pReceiver-M02连接顺序正确,其序列与GeneBank中人CXCR4基因(NM003467)的标准序列完全一致。3稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株的筛选G418的筛选浓度为600μg/ml。细胞转染14 d后经有限稀释法获得了数个单细胞,将单细胞进行扩大培养。转染细胞的形态和生长速度未发生明显变化,伸展速度较未转染细胞慢,将转染真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4和空载体pReceiver-M02的细胞分别命名为SKOV3/CXCR4和SKOV3/neg细胞。4稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株的鉴定转染细胞通过RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学三种方法进行鉴定。通过上述三种方法证实转染效率平均为73%。5 CXCL12-CXCR4相互作用对卵巢癌细胞生长的影响MTT法观察100ng/mlCXCL12单独作用可促进SKOV3/CXCR4细胞增殖,且能被10μg/ml CXCR4中和抗体与1μg/ml CXCR4拮抗剂AMD3100所抑制(F=256.89,P＜0.05)。对于SKOV3/neg和SKOV3细胞来说,加入各个浓度梯度的CXC12及CXCR4中和抗体或CXCR4拮抗剂AMD3100,细胞的生长未发生明显变化,各组之间比较无统计学意义(F=0.31,P＞0.05)(F=0.92,P＞0.05)。6 CXCL12-CXCR4相互作用对卵巢癌细胞迁移的影响对于SKOV3/CXCR4细胞来说,100ng/ml CXCL12使迁移的细胞数明显增多,且能被10μg/ml CXCR4中和抗体与1μg/mlCXCR4拮抗剂AMD3100所抑制(F=393.21,P＜0.05),对于SKOV3/neg和SKOV3细胞来说,加入各个浓度梯度的CXCL12及CXCR4中和抗体与CXCR4拮抗剂AMD3100,细胞的迁移数目未发生明显变化,各组之间比较无统计学意义(F=0.41,P＞0.05)(F=0.62,P＞0.05)。7 CXCL12-CXCR4相互作用对卵巢癌细胞侵袭的影响当下室为无血清的培养液时,SKOV3/CXCR4细胞穿过Matrigel的细胞数很少,CXCL12作用后,穿过Matrigel的细胞数较对照组增多;当上室加入10μg/ml CXCR4中和抗体与1μg/mlCXCR4拈抗剂AMD3100,能够抑制细胞的趋化性侵袭(F=16.65,P＜0.05);对于SKOV3/neg和SKOV3细胞来说,加入各个浓度梯度CXCL12及CXCR4中和抗体与CXCR4拮抗剂AMD3100,各组细胞的侵袭数目相比无显著性差异(F=0.04,P＞0.05)(F=0.05,P＞0.05)。结论:1真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4构建成功,通过测序证实;稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株SKOV3/CXCR4构建成功,通过RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学三种方法鉴定,为后续研究提供工具和平台。2 CXCL12-CXCR4相互作用促进卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭;CXCR4中和抗体或CXCR4的拮抗剂AMD3100可抑制卵巢癌细胞的生长转移,表明CXCL12-CXCR4生物轴在卵巢癌的生长和侵袭转移过程中起着重要作用。