冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病,已成为目前全球导致死亡最多的疾病之一,临床治疗方法包括药物治疗、介入治疗和外科手术治疗。胺碘酮(Amiodarone,AMD)是Ⅲ类(钾通道阻滞剂)抗心律失常药物,同时具有扩张冠状动脉和改善心肌供血的作用,但是,该药长期使用很容易引起非靶器官部位的药物蓄积,导致一系列不良反应,从而制约了胺碘酮的临床应用。纳米脂质体(Nanoliposome,NLPs)具有类细胞结构,能够改变包封药物的体内分布,提高药物的治疗指数、减少药物的使用剂量和降低药物的毒性,目前,在心血管领域中应用的主要为普通胺碘酮脂质体(AMD-NLPs)或单靶头修饰的纳米脂质体载药系统,但仍存在一些不足,主要表现为:①药物包封率不够理想,缓释过快;②组织器官的特异选择性不强,其在提高药物心脏内导入的同时,也可能增加其他组织器官的药物分布;③药物导入心脏后,往往难以进一步导向至病灶部位,使治疗效果受到很大影响,不能长久维持有效的药物浓度。因此,更多的研究者致力于开发和研制新的药物载体,并对载体进行靶头修饰,从而使得药物的靶向性更强,疗效更好。本研究拟构建一个双重靶向的纳米脂质体系统,即将两种不同靶向作用的功能纳米材料PCM-1(W L S EAGPVVTVRA L R G T G S W,心肌细胞特异性靶向肽)和TAT(YGRKKRRQRRR,细胞穿膜肽)组合在普通纳米脂质体系统中构建成具有双重靶向效果的胺碘酮纳米脂质体(PCM-1/TAT AMD-NLPs,简称PTA-NLPs)系统,选用胺碘酮作为药物,通过高压均质法制备了PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体,采用心肌细胞(Myocardial Cells,MCs)评价PTA-NLPs的细胞毒性和摄取能力,通过建立大鼠心肌梗死模型后将双重靶头的AMD纳米脂质体缓慢尾静脉注射,检测模型大鼠的心电图ST段数据,测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙二醛(MDA)的含量,观察大鼠心肌梗死面积等,评价双重靶头是否比单靶头修饰的胺碘酮脂质体具有更强的心肌靶向性,更易富集于心肌部位。第一部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的制备和表征目的:构建PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体(PTA-NLPs)并对PTA-NLPs进行表征分析。方法:1、称取大豆磷脂60mg、胆固醇30mg、DSPE-PEG2000-PCM-1 3mg和DSPE-PEG2000-TAT 2mg于烧瓶中,加入三氯甲烷5mL溶解;另称取处方量的胺碘酮2mg于烧瓶中,加入无水乙醇2mL溶解,于50℃恒温磁力搅拌条件下,将乙醇溶液以注射器缓慢滴加至三氯甲烷溶液中,得到粗纳米混悬液。再于冰浴条件下以一定功率(工作4s,间歇2s)进行超声分散,得均匀纳米脂质体溶液,后经旋转蒸发除去有机溶剂,得均匀薄膜,真空干燥2h后,加入2mLPBS(Phosphate Buffer Saline,磷酸缓冲盐)进行水化,后经冻干,得胺碘酮纳米脂质体。2、用激光散射粒度仪分别测定纳米脂质体的光散射粒径和Zeta电位,测定前样品用双蒸水3mL稀释。取纳米脂质体溶液0.5mL,应用2%磷钨酸1mL负染色制备样品,混匀后将铜网有Formavar支持膜的一面盖于染液液滴上,正染色15～30min,铜网自然晾干后于透射电镜下观察纳米脂质体的形态。3、将所制备的PTA-NLPs冻干粉放置于无菌西林瓶中,密闭保存于0～4℃冰箱冷藏,分别于放置后的1、2和3月后取样10mg,测定PTA-NLPs的粒径与包封率,并通过电子显微镜观察其稳定性。结果:1、所制备的 PTA-NLPs 粒径为(124.31±13.62)nm,PDI(Polydispersity Index,多分散指数)为 0.21,包封率为(88.61±4.23)%,Zeta 电位为(-17.53±1.91)mV。2、使用单因素考察方法筛选出优化的处方为:胺碘酮2mg、大豆磷脂60mg、胆固醇 30mg、DSPE-PEG2000-PCM-1 3mg、DSPE-PEG2000-TAT2mg 和水化介质 2mL。3、透射电子显微镜观察显示本品外观呈类球型,表面光滑,无相互聚集现象,分散均匀;将PTA-NLPs于冷藏条件下避光保存3个月后,粒径、zeta电位等基本特征不变,表明其稳定性良好。结论:1、通过高压均质法制备PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体,并通过单因素观察方法筛选出优化的处方配比。2、根据优化的处方配比所制备的PTA-NLPs粒径为(124.31±13.62)nm,PDI为 0.21,包封率(88.61±4.23)%,Zeta 电位(-17.53±1.91)mV。3、根据优化的处方配比所制备的PTA-NLPs,透射电镜下观察到外观呈类球型,表面光滑,无相互聚集现象,在冷藏条件下保存3个月后基本特征不变,稳定性良好。第二部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的体外评价目的:通过体外方法评价PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体(PTA-NLPs)的体外释放度、对MCs生长抑制情况及MCs对PTA-NLPs的摄取能力。方法:1、采用透析袋方法评价PTA-NLPs的体外释放行为。称取PTA-NLPs 100mg置于截留分子量8000～12000的透析袋中,扎紧袋口,放入装有200mL PBS(pH=7.4)释放介质中,于37℃恒温水浴中、200转/分振荡下进行释放试验,在释放开始后的0.5、1、2、3、4、6、8、10和12h抽取介质1mL,用0.45μm微孔滤膜过滤;同时,用相同剂量的 free AMD、A-NLPs(AMD-NLPs)、PA-NLPs(PCM-1 AMD-NLPs)和 TA-NLPs(TAT AMD-NLPs)作为对照;用 HPLC(High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱)测定各样品在各时间点介质中药物的实际测定浓度C测,按公式c校=c测+1/200(?)c测 算得校正浓度,以校正浓度计算累积释放百分率。2、用96孔培养板将MCs在37℃和5%CO2的培养箱中培养24小时,丢弃培养液,用PBS仔细洗涤细胞两次,然后加入不同的AMD制剂(free AMD、A-NLPs、PA-NLPs(PCM-1 AMD-NLPs)、TA-NLPs 和 PTA-NLPs),剂量从5μg/mL 到 50μg/mL,加入60μL噻唑蓝溶液(5mg/mL)和1mL的培养液,在培养箱中孵育4小时,检测胺碘酮纳米脂质体对MCs生长的抑制作用。将上清液吸出并丢弃,每个孔加入150μL的DMSO(Dimethyl Sulfoxide,二甲基亚砜),置平坦摇床上震荡5分钟,在570nm处用酶标仪测定吸光度值(A),计算细胞抑制率=[(A空白对照组-A给药组)/A空白对照组]×100%。3、采用绿色荧光的香豆素-6(C6,浓度为100mg/mL)为荧光探针,按AMD纳米脂质体的制备方法,结合薄膜水化法将C6包埋于纳米脂质体的亲脂性内核中,即可获得带绿色荧光的AMD相关纳米脂质体。在12孔培养板中接种MCs,培养液为含10%牛血清的DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium,含各种氨基酸和葡萄糖的培养基),控制细胞密度为4.0×105个/孔,培养时间为24小时,然后将各组AMD制剂(free AMD、A-NLPs、PA-NLPs、TA-NLPs 和 PTA-NLPs),分别与 MCs 共同孵育2小时后,用PBS溶液(pH 7.4)洗涤细胞3次,尽可能清除细胞外残留的荧光物质,最后使用激光扫描共聚焦显微镜观察香豆素-6在细胞内的分布情况。同时,用胰酶消化MCs为单细胞悬液后采用流式细胞仪进行定量检测,测定荧光强度。结果:1、PTA-NLPs在pH=7.4的PBS溶液中进行体外释放12h,累积释放百分率仅为(53.3±0.3)%,具有较强的缓释性能,PTA-NLPs的缓慢释放特性有利于系统在体内的稳定性从而改变药物本身的体内分布行为。2、通过 MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,噻唑蓝)实验,比较了 free AMD 组、A-NLPs 组、PA-NLPs 组、TA-NLPs 组和 PTA-NLPs组的细胞毒性,直至当浓度达到50μg/mL时,各组制剂都明显抑制了心肌细胞的生长,且与对照组相比有显著的统计学差异(p<0.05),但当浓度小于50μg/mL时,各组制剂均对心肌细胞活性没有明显影响(p>0.05)。3、采用流式细胞仪检测心肌细胞对PTA-NLPs摄取的计数为102～103个,明显优于对PA-NLPs和TA-NLPs的摄取,表明PCM-1和TAT共同修饰后可以起到协同增效的作用,增加AMD药物进入心肌细胞的能力。结论:1、PTA-NLPs体外释放12h的累积释放百分率仅为(53.3±0.3)%,表明PTA-NLPs具有较强的缓释性能,有利于载药系统在体内的稳定性,从而改变药物本身的体内分布行为。2、PTA-NLPs浓度小于50 μg/mL时没有明显的细胞毒性。3、MCs对PTA-NLPs的摄取能力明显优于PA-NLPs和TA-NLPs,表明PCM-1和TAT共同修饰后可以起到协同增效的作用,增加AMD药物进入心肌细胞的能力。第三部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的药动学及组织分布研究目的:探讨PTA-NLPs系统在实验动物中的药动学和组织分布。方法:1、采用HPLC检测方法检测AMD在体内的药物浓度。取空白血浆0.3mL分别加入不同量的AMD贮备液,制备成浓度为50 ng/mL、500ng/mL和2500ng/mL的标准血样,每种浓度重复3次,以药物峰面积比值(A)对药物浓度(C)进行线性回归,得标准曲线方程(A=7.276C-1.283)。大鼠尾静脉注射给药后进行HPLC测定药物峰面积,由标准曲线计算AMD在体内的药物浓度。2、将30只健康Sprague Dawley大鼠随机分为5组,每组6只。各组(AMD溶液剂、A-NLPs、PA-NLPs、TA-NLPs和PTA-NLPs)分别通过尾部静脉给予5mg/kg,分别在给药前和给药后的0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h通过眼部静脉采血0.6mL,收集于加有肝素的聚丙烯离心管内,12000r/min离心1 min,分离血浆并于-18℃冰箱中储存,待作血药浓度分析。3、将180只健康昆明种小鼠随机分为5组,每组36只,每组每个时间点重复6只小鼠。各组(AMD 溶液剂、A-NLPs、PA-NLPs、TA-NLPs 和 PTA-NLPs)分别通过尾部静脉给予5mg/kg,分别在给药后的0.5、1、2、4、8和12h摘眼球取血约0.6mL,置于事前加过肝素的离心管中,12000r/min离心10min后分离血浆,于-20℃保存待测药物浓度。同时,断颈处死小鼠,取出心、肝、脾、肺和肾,用适量生理盐水清洗,经滤纸吸干血浆,用于组织药物浓度的测定和应用苏木精-伊红(H&E)染色观察组织病理学变化。结果:1、HPLC测定显示AMD峰形对称,陡尖,分离度良好,主峰附近无杂质峰干扰。不同浓度(50ng/mL、500 ng/mL和2500ng/mL)血浆和组织样品的方法回收率在90～105%之间,提取回收率均>(70±3)%,日内及日间RSD(Relative standard deviation,相对标准偏差)差异有统计学意义(P<0.05)。2、AMD溶液剂组给药后的药物浓度是几组中最高的(313.3ng/mL),但随后浓度迅速下降(消除半衰期为2.6h),10h时已完全代谢。当AMD以NLPs形式进入体内后其达峰的血药浓度显著下降,维持在130～160ng/mL,但消除半衰期明显延长,双重修饰的AMD-NLPs消除半衰期可达到7.2h,10h时浓度为30.70ng/mL,24h时血药浓度为11.16ng/mL。3、在实验组(PTA-NLPs)药物在不同组织中分布有明显差异,特别是在心脏,PTA-NLPs组小鼠心脏1h时的胺碘酮浓度达到354ng/g,明显高于其他组织和血浆,有明显统计学差异(P<0.05)。病理切片观察发现PTA-NLPs组小鼠在给药12h后各个脏器未见明显组织学变化。结论:1、建立HPLC方法用于AMD浓度的测定,验证了血浆样品和组织样品的AMD测定方法,该测定方法符合生物样品分析要求,具有专属性好、灵敏度高和简单等特点。2、PTA-NLPs系统的药动学和组织学分布研究表明PTA-NLPs系统不仅能延缓药物在体内的释放起到长循环效应,而且更多地富集于心脏且无器官的组织学变化,为后续的临床疗效研究打下了基础。第四部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的药效学研究目的:构建大鼠心肌梗死模型进行AMD纳米脂质体的药效学评价。方法:将90只SD大鼠随机分成9组,每组10只,分为假手术组、模型组、AMD组、A-NLPs 组、PA-NLPs 组、TA-NLPs 组、PTA-NLPs(低剂量)组、PTA-NLPs(中剂量)组和PTA-NLPs(高剂量)组。将SD大鼠用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)行腹腔注射,麻醉后仰卧固定在动物手术台上,气管插管后连接动物呼吸机,采用标准Ⅱ导联记录大鼠心电图,沿胸骨左缘第2～4肋间隙开胸,暴露心脏,剪开心包膜,采用无创缝合丝线在左心耳下距主动脉根部2-3mm处用6-0线穿过一小束心肌并结扎冠状动脉前降支(假手术组仅穿线不结扎),心电图Ⅱ导联ST段抬高作标志心肌梗死模型制备成功。根据分组,在冠状动脉结扎后5min缓慢尾静脉注射不同的制剂。采用大鼠心电图机监测心电图,记录各组给药后30、60、90和120min的ST段变化情况。注射给药120min后解剖大鼠,打开腹腔,用无菌注射器抽取腹主动脉血约5mL,静置5min后离心分离血清,测定大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙二醛(MDA)的含量。抽取腹主动脉血液后迅速剪开胸腔摘取心脏,用PBS冲洗心脏去除血迹,沿冠状沟切除右心室,保留左心室,沿心尖到心基底部方向平行在结扎线以下将心室切成4-5 片,置 0.1%NBT(Nitro-Blue Tetrazolium,氮蓝四唑)染液中 37℃孵育10min 后取出,用滤纸吸尽水分,用Image ProPlus 6.0图像分析软件处理图像,求算心肌梗死区面积和左心室面积,按两者之比计算心肌梗死面积比(心肌梗死面积比=梗死区面积/左心室面积)。结果:1、ST段的变化:在120min的观察期内模型组大鼠ST段抬高维持在一个比较高的水平,没有下降趋势;接受不同AMD制剂大鼠的ST段均有不同程度的下降,双重靶头AMD纳米脂质体高剂量组的ST段下降最为显著,达到(0.09±0.07)mV,与其他几组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。2、生化指标变化:与模型组比较,各AMD组急性心肌梗死模型大鼠血清中的CK、LDH、AST和MDA水平均下降,双重靶头修饰的纳米脂质体效果明显优于单靶头纳米脂质体,以PTA-NLPs在的下降幅度最大(CK:(3289.50±1102.90)U/L;LDH:(1854.60±191.30)U/L;AST:(583.50±142.70)U/L;MDA:(8.20±2.10)U/L;P<0.05)。3、心肌梗死面积:模型组大鼠的心肌梗死面积比在38%左右,给予不同AMD制剂后,各组的心肌梗死面积比均有不同程度的下降,高中低三个剂量的双靶头AMD纳米脂质体组均显著减小心肌梗死面积比,PTA-NLPs高剂量组(13%)的心肌梗死面积比下降最为显著。结论:1、大鼠急性心肌梗死模型各AMD组的ST段抬高均有不同程度的下降,以高剂量PTA-NLPs组下降幅度最显著,表明双重靶头胺碘酮脂质体(尤其高剂量)比单靶头胺碘酮脂质体更明显地降低模型大鼠的ST段。2、双重靶头胺碘酮脂质体AMD(尤其高剂量)比单靶头胺碘酮脂质体显著降低心肌梗死模型大鼠血清中的CK、LDH、AST和MDA水平。3、不同AMD制剂组的心肌梗死面积比均有不同程度的下降,以高剂量PTA-NLPs组的下降幅度最显著,表明双重靶头脂质体(尤其高剂量)比单靶头脂质体能使模型大鼠的心肌梗死面积减小更明显。