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捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于牛、羊等反刍动物的皱胃,以吸食血液为生的寄生性线虫。捻转血矛线虫病可导致宿主出现消化系统综合征和贫血症,对宿主的健康以及畜牧业的发展造成了极大的威胁。虽然广谱驱虫药对捻转血矛线虫病的治疗有一定的效果,但是捻转血矛线虫耐药性的日益增强,导致捻转血矛线虫病的防控面临新的挑战。血红素作为多种蛋白质的辅助因子,是绝大多数生命体所必须的物质。然而,包括捻转血矛线虫在内的多数寄生性线虫都缺乏内源性血红素生物合成途径,需要摄取和利用源自于环境或宿主的血红素。因此,合理调控血红素的摄取、转运及代谢对寄生虫的生存和繁殖至关重要,探明该机制可能为寻找药物和疫苗的潜在靶标提供依据。本研究在捻转血矛线虫中鉴定了两种血红素应答基因（heme-responsive-gene）Hc-hrg-1和Hc-hrg-2,对其编码蛋白的结构、功能域以及进化关系进行系统分析,探明基因的血红素应答模式及表达特性;分析Hc-HRG-1蛋白的血红素结合能力,并利用RNA干扰实验探究其在捻转血矛线虫幼虫期血红素转运中发挥的功能;利用酵母血红素斑点实验、Ga PPIX毒性耐受实验,验证Hc-HRG-1蛋白直接参与血红素摄取,并分析其参与血红素摄取的关键氨基酸位点;通过酵母双杂交系统筛选Hc-HRG-1的互作蛋白,并对两者的互作模式进行了初步探究。本研究为深入了解捻转血矛线虫血红素转运机制奠定了基础,也为药靶的筛选提供了新的思路。1.捻转血矛线虫Hc-hrgs基因血红素应答特性分析本研究利用PCR扩增及Genome walking技术获得Hc-hrgs基因序列,对其基因结构、功能域和进化关系等进行系统性预测和分析,利用实时荧光定量PCR技术分析Hc-hrgs在不同发育时期的血红素应答特性。实验结果表明,Hc-HRG-1蛋白具有与血红素的结合和转运相关的HRG superfamily功能域,Hc-HRG-2蛋白具有硫氧还原蛋白样折叠功能域（GST-N）和谷胱甘肽S-转移酶-C-末端功能域（GST-C）。血红素应答特性分析表明,Hc-hrg-1的转录水平在幼虫和成虫期呈现相似的血红素浓度依赖模式,而Hc-hrg-2的转录水平仅在幼虫期表现出明显的血红素浓度依赖模式。2.Hc-HRG-1表达特性分析本研究通过实时荧光定量PCR技术比较Hc-hrg-1基因在捻转血矛线虫不同发育时期的转录水平特点;通过免疫荧光组织化学技术分析Hc-HRG-1蛋白在捻转血矛线虫成虫中的组织定位;利用模式生物秀丽隐杆线虫异源表达Hc-HRG-1蛋白,分析其表达特征;利用哺乳动物Hela细胞系对Hc-HRG-1蛋白与相关细胞器标记物进行共定位分析,明确Hc-HRG-1蛋白的表达特性。实验结果表明,Hc-hrg-1在L3期转录水平最高,在体内寄生时期的转录水平次之,在虫卵期转录水平最低。在捻转血矛线虫成虫体内,Hc-HRG-1主要表达于肠道基底外侧膜、肌肉表层（接触假体腔）、生殖系统以及胚胎细胞外膜上;在秀丽隐杆线虫中,Hc-HRG-1主要表达在肠细胞顶质体膜上,在细胞内有点状聚集;在Hela细胞中,Hc-HRG-1在细胞膜、内体-溶酶体细胞器均有表达。本研究通过多种手段明确Hc-HRG-1在组织和细胞水平的表达特性,为后续蛋白的功能研究奠定基础。3.Hc-HRG-1参与血红素转运的功能研究为进一步探明Hc-HRG-1蛋白在血红素转运中的功能,本研究通过体外血红素结合实验分析该蛋白是否能够直接与血红素进行相互作用;通过在秀丽隐杆线虫和捻转血矛线虫体内的RNA干扰实验分析Hc-hrg-1在捻转血矛线虫幼虫期血红素转运中发挥的功能。实验结果表明,Hc-HRG-1是一种血红素结合蛋白;Hchrg-1异源干扰秀丽隐杆线虫可部分抑制Ce-hrg-1的转录,并导致线虫肠细胞溶酶体内蓄积大量荧光血红素类似物Zn MP,且Hc-HRG-1在秀丽隐杆线虫肠细胞内的点状聚集和Zn MP在肠细胞的分布存在部分共定位;在捻转血矛线虫中干扰Hc-hrg-1的转录会导致幼虫出现生长发育缺陷,而外源血红素可以在一定程度上拯救该表型,抑制Hc-hrg-1的转录还可以提高幼虫对毒性血红素类似物Ga PPIX的耐受性。本研究主要通过RNA干扰手段明确Hc-HRG-1参与血红素的摄入以及肠细胞溶酶体内血红素的转运调控,并且对幼虫的生长发育非常重要,可为后续捻转血矛线虫血红素转运机制的研究提供基础。4.Hc-HRG-1参与血红素转运的关键位点分析为了直接证明Hc-HRG-1蛋白的血红素摄取功能,本研究利用血红素斑点实验、Ga PPIX毒性耐受实验分析外源表达Hc-HRG-1蛋白是否能够促进酿酒酵母对血红素摄取;利用点突变技术将相关的氨基酸位点进行单突变,以明确HcHRG-1参与血红素摄取的关键氨基酸位点。实验结果表明,外源表达Hc-HRG-1可以促进酿酒酵母对血红素的摄取和利用,并拯救血红素合成缺陷型酵母的生长;利用点突变技术成功筛选出Hc-HRG-1参与血红素摄取的关键氨基酸位点,分别为H52、H97、C2、T29和T50位点。本研究以酿酒酵母为模式生物,验证了HcHRG-1蛋白能直接参与血红素摄取,并明确了Hc-HRG-1参与血红素摄取的关键氨基酸位点,为研究Hc-HRG-1蛋白的血红素摄取机制奠定基础。5.Hc-HRG-1互作蛋白的鉴定及互作模式的初步探究为了进一步探索Hc-HRG-1参与血红素转运的分子机制,本研究利用酵母双杂交系统筛选Hc-HRG-1的互作蛋白;通过酵母回转验证、细胞共定位分析、免疫共沉淀及Pull-down技术进一步验证Hc-HRG-1与捕获蛋白之间的互作关系;对Hc-HRG-1进行截短表达,通过免疫共沉淀技术鉴定互作关键区域;通过RNA干扰实验对互作模式进行初步探究。实验结果表明,Hc-HRG-1与Hc-VHA-2（VATPase的c型亚单位）存在互作关系,且互作关键功能域为Hc-HRG-1的第三个和第四个跨膜结构域区域。RNA干扰Hc-vha-2的转录后会导致捻转血矛线虫幼虫出现生长发育缺陷,并会导致Hc-hrg-1基因转录水平显著上调,推测HcHRG-1对血红素的转运可能需要依赖Hc-VHA-2的活性。本研究通过互作蛋白的筛选、鉴定以及互作模式的初步探究,为揭示Hc-HRG-1参与血红素转运的分子机制奠定基础。综上所述,本研究扩增获得了两种捻转血矛线虫Hc-hrgs基因,通过生物信息学手段对编码蛋白的结构,功能域以及进化关系进行了系统分析,明确了其血红素应答特性及表达特性。通过体外血红素结合实验和体内RNA干扰实验明确该基因参与捻转血矛线虫肠道内血红素的摄取和转运。以酿酒酵母为模式生物,验证了Hc-HRG-1蛋白能直接参与血红素摄取,并鉴定了H52、H97、C2、T29和T50为其参与血红素摄取的关键氨基酸位点。利用酵母双杂交系统筛选HcHRG-1的互作蛋白,推测Hc-HRG-1对血红素的转运可能需要依赖Hc-VHA-2的活性。上述结果初步揭示了Hc-HRG-1参与捻转血矛线虫血红素转运的分子机制,同时为开发针对捻转血矛线虫病的新药和疫苗提供了新的思路。