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多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是环境中广泛存在的一种持久性有机污染物,具有致畸性致癌性和致突变性,对人类健康和环境都有很大危害。实验室前期筛选到一株能够降解菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘五种混合多环芳烃的菌株Sphingobium sp. FB3,该菌株对四环多环芳烃荧蒽具有高效降解功能并且能以荧蒽为唯一碳源和能源生长。目前,关于微生物中与荧蒽降解相关基因的研究较少,本文对Sphingobium sp. FB3中降解荧蒽的关键基因进行克隆并对其编码的酶功能进行分析。采用三亲接合方式将转座子Mariner随机插入到菌株FB3基因组DNA中,构建随机插入突变子文库。将突变子接种于以荧蒽为唯一碳源和能源的无机盐培养液中,以是否使培养液产生颜色变化或是否产生与接种菌株FB3时产生的颜色不同为筛选标记,筛选到两株不能使培养液产生颜色的突变子5-41和12-45和三株能够在短时间内使培养液积累颜色的突变子1-45,5-49和6-91。分别对五个突变子侧翼序列进行扩增、测序,测序结果显示Mariner在突变子5-41和12-45中的插入位点分别为编码环羟化双加氧酶末端氧化酶组分α亚基和铁氧还蛋白组分的基因上,初步认为菌株FB3中这两个基因可能与荧蒽降解相关。根据侧翼序列扩增结果并结合菌株FB3基因组测序结果分析,转座子Mariner在1-45,5-49和6-91上的插入位点分别为编码酒石酸脱氢酶、转座酶和整合酶的基因上。对Sphingobium sp. FB3基因组进行测序并分析了测序结果,已获得的基因组由4.6MB组成,G+C%为63.47%,包含155个scaffolds。突变子5-41中Mariner插入位点定位在scaffold91上,将被转座子Mariner插入的基因命名为flnAlf其下游基因命名为flnA2f。突变子12-45中Mariner插入位点定位在scaffold120上,将被转座子Mariner插入的基因命名为flnA3,距其下游18.3kb左右处基因命名为flnA4。这两个scaffolds包含了大量的PAHs降解所需基因。在E coli. BL21(DE3)中共表达编码环羟化双加氧酶FlnA的基因flnAlf, flnA2f, jlnA3和flnA4,诱导菌株Ecoli. BL21FlnA在12h内能够催化43%的荧蒽母体化合物降解,通过气相色谱质谱联用检测产生的代谢物为单羟基荧蒽,证明了由以上四个基因编码的环羟化双加氧酶FlnA是Sphingobium sp. FB3降解荧蒽关键的酶,以上四个基因参与了荧蒽的降解过程。在Ecoli. BL21(DE3)中仅表达基因flnAlf, flnA2f,诱导菌株E coli. BL21FlnA12不能催化荧蒽产生相应的代谢产物,说明FlnA3和FlnA4是FlnA表现活性的必要组分。对FlnA底物范围研究表明,FlnA能够催化菲、蒽和芘产生相应的二氢二醇代谢物,说明上述四个基因是Sphingobium sp. FB3降解菲、蒽和芘的关键基因。以Sphingobium yanoikuyae B1的环羟化双加氧酶组分末端氧化酶α亚基三维结构为模板预测了Sphingobium sp. FB3中对应的α亚基(由flnA1f编码)的三维结构,并且对活性位点进行预测。通过AutoDock Vina软件研究了苯并[a]芘与α亚基活性位点的结合情况,结果表明苯并[a]芘能够以四种位置结合在α亚基活性位点中。将α亚基的223号氨基酸PHE突变为LEU可以提高FlnA对苯并[a]芘的转化效率,也可提高对菲、蒽、荧蒽和芘的催化作用,表明FlnA1f中223号氨基酸为环羟化双加氧酶FlnA中影响底物催化作用的关键氨基酸。