研究背景维生素D(Vitamin D,VD)是一类由固醇衍生而来的脂溶性维生素,主要有麦角钙化醇(ergocalciferol,VD2)和胆钙化醇(cholecalcif-erol,VD3)两种形式。这两种形式的维生素D均无生物活性,必须在体内经肝脏转化为25-羟基维生素D,再经肾脏转化为1,25(OH)D后才能发挥生物效应。虽然1,25-羟维生素D是维生素D的主要活性形式,但其半衰期短(4-6h),相对含量波动较大,而25-羟基维生素D是维生素D在血液中的主要运输形式,半衰期较长(3-4周),波动范围小,故临床上把血清中25-羟基维生素D水平作为衡量维生素D含量的最佳指标。一直以来人们应用它来防治儿童佝偻病、成人的软骨病及骨质疏松。近年大量研究发现维生素D不仅与骨骼疾病有关,还与癌症、心脏病、神经系统疾病、免疫功能、感染性疾病等重要疾病具有密切关系。精准的检测维生素D含量可指导临床医师对骨骼相关疾病及非骨骼系统疾病的诊断和治疗。传统检测25-羟基维生素D的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LCMS/MS)、竞争蛋白结合法(CPBA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)等;但用这些方法检测维生素D存在样品制备步骤繁琐、设备昂贵、有放射性污染、对温湿度及反应时间对结果影响大等缺点。本研究采用光激化学发光(Light initiated chemiluminescence assay,LiCA)技术检测25-羟基维生素D,它是光激发产生的均相化学发光技术,是以纳米级微球为基础的新型化学发光检测技术。此技术与传统的非均相免疫分析技术相比,实现了免清洗和高通量检测,它具有高灵敏、低本底、易使用、高通量、操作简便、快速等优点。目的建立光激化学发光技术检测血清25-羟基维生素D含量的方法,进行方法学评估。方法1、双抗体夹心模式LiCA检测25-羟基维生素D:选用针对25-羟基维生素D抗原的一个单克隆抗体和两个多克隆抗体,用棋盘滴定法,将抗体(一种包被发光微球,另一种进行生物素化)两两配对筛选出最佳双抗体组合,进一步确定双抗体最佳反应浓度,从而建立双抗体夹心模式的光激化学发光技术检测25-羟基维生素D的方法,制作标准曲线,评价此方法。2、竞争模式LiCA检测25-羟基维生素D:选用针对25-羟基维生素D抗原的一个单克隆抗体和两个多克隆抗体,用棋盘滴定法,将三个抗体分别包被发光微球后与生物素化25-羟基生素D配对,筛选出最佳抗体,进一步确定发光微球抗体与生物素化25-羟基生素D的最佳反应浓度,从而建立竞争模式的光激化学发光技术检测25-羟基维生素D的方法,制作标准曲线,评价此方法。结果1.采用棋盘滴定法筛选出的两种最适抗体分别与发光微球及生物素连接,成功的建立了双抗体夹心模式的LiCA技术定量检测25-羟基维生素D的方法。此检测方法灵敏度为2.98ng/mL,在2.98-152ng/mL检测范围内线性较好。批内平均变异系数为4.40%,天间平均变异系数为7.50%,在25-羟基维生素D浓度较高时仍无Hook效应。将低值、正常及高值25-羟基维生素D标本共110份用双抗体夹心模式的LiCA法和ELISA法同时检测并对比结果,得出两种方法有良好的相关性(r=0.9284),利用此法建立的25-羟基生素D参考值范围是18.85-46.44ng/mL。2.采用棋盘滴定法从三种抗体中筛选出一种最适抗体包被发光微球与生物素化的25-羟基维生素D共同建立了竞争模式的LiCA技术定量检测25-羟基维生素D的方法。此检测方法的灵敏度为1.95ng/mL,在1.95-152ng/mL检测范围内线性较好。批内平均变异系数为5.71%,天间平均变异系数为7.43%,25-羟基维生素D浓度较高时仍无Hook效应。将低值、正常及高值25-羟基维生素D标本共110份用竞争模式的LiCA法和ELISA法同时检测并对比结果,得出两种方法有良好的相关性(r=0.9566),利用此法建立的维生素D参考值范围是19.41-46.23ng/mL。结论成功建立了双抗体夹心模式及竞争模式的LiCA技术定量检测25-羟基维生素D的检测方法。这两种模式的LiCA定量检测25-羟基维生素D均具有灵敏度高、准确性好、稳定性好、免洗板、线性范围宽、高通量、可靠、检测快速等特点。经比较该方法与ELISA法检测25-羟基维生素D相关性较好,由此可见,光激化学法光技术检测25-羟基维生素D具有极好的临床应用价值。