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杀稻瘟菌素blasticidin S（BS）是肽核苷类抗生素家族的一员,最早从Streptomyces griseochromogenes中发现并分离纯化得到,它是首个替代有机汞农药用于防治水稻稻瘟真菌病的生物制剂,其作用机制是通过抑制蛋白质合成,从而达到杀死病原菌的作用。由于其活性高于有机汞,且对鱼类无害,BS曾经在日本等亚洲市场广泛应用,取得了良好的防治效果;由于哺乳动物细胞对BS的高敏感性,BS目前主要用作真核细胞转基因工程筛选试剂。BS原始产生菌S.griseochromogenes的遗传操作困难,阻碍了其生物合成途径的研究。为了克服这种不足,BS的生物合成基因簇被嫁接到了变铅青链霉菌S.lividans基因组上,并敲除其中的脱氨酶（deaminase）基因-SLBSD,获得了BS的异源表达菌株WJ2。WJ2发酵产物分析发现除了最终产物BS外,还有三种与BS核心结构相似的代谢物,即去甲基杀稻瘟菌素demethylblasticidin S（DBS）、亮氨酰去甲基杀稻瘟菌素leucyldemethylblasticidin S（LDBS）和亮氨酰杀稻瘟菌素leucylblasticidin S（LBS）。这三种中间物与最终产物在体内合成的先后顺序是怎样的,以及哪些蛋白参与了它们之间的相互转化?这些问题尚不清楚,本研究主要针对上述问题,最终确定BS的生物合成途径。BS的生物合成基因簇于2003年报道,其必需基因簇包含从blsD,E,F,G,H,I,J,K到L的同向开放阅读框以及反向排列的blsM。BS生物合成的最初步骤是通过BlsM将CMP水解产生胞嘧啶,然后通过BlsD将游离胞嘧啶转移至葡萄糖醛酸产生胞嘧啶葡萄糖醛酸（CGA）,除此之外,其他编码蛋白的功能未知。本研究聚焦于BS合成过程中的中间产物DBS的亮氨酰化,因为加载亮氨酰基团之后的LDBS和LBS抑菌活性显著下降。在最终产物BS中,亮氨酰被PepN水解掉,因此亮氨酰基团的加载被认为是BS产生菌独特的自我保护机制。blsK和blsL是BS生物合成基因簇中排列靠后的两个基因,序列比对发现许多蛋白与BlsK同源,但全都被注释为未知功能的蛋白,这暗示它们组成了一个新的蛋白家族。blsK基因突变株WXK3不再产生LDBS和LBS,只有DBS和微量的BS积累,暗示BlsK负责了DBS或BS的亮氨酰化。纯化的BlsK与DBS孵育时不能形成LDBS,而过表达BlsK的无细胞抽提液（CFE）却能催化生成LDBS,暗示CFE中存在BlsK活性必需的辅因子。我们发现当向CFE中添加RNase A时,LDBS不再生成;当向纯化的BlsK体外反应体系中加入tRNAs时,LDBS可以生成;当补加亮氨酰tRNA合成酶（LRS）时,LDBS生成效率进一步提高。当以制备的Leu-tRNALeu为底物时,BlsK可以直接将亮氨酰基团转移到DBS上生成LDBS,这说明BlsK是一个亮氨酰tRNA依赖的氨酰基转移酶。当反应体系中亮氨酸过量时,BlsK能在LDBS亮氨酰的α氨基上加载第二个亮氨酸生成LLDBS;以上结果说明在BS的生物合成途径中,BlsK负责催化亮氨酸加载到DBS上形成LDBS。在纯化BlsK的过程中,我们注意到蛋白溶液呈棕红色,无还原剂DTT保护或长时间暴露在空气中时容易沉淀,推测BlsK是一个[Fe-S]蛋白。UV-VIS光谱分析发现BlsK蛋白溶液在420 nM左右有[Fe-S]簇的特征吸收峰。电子顺磁共振（EPR）分析显示BlsK有一个g=2.01（S=1/2）的信号,而当加入还原剂连二亚硫酸钠（DT）时信号消失。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析确定了每一个蛋白含有3.253个Fe原子和4.336个S原子,以上结果显示BlsK含有一个[3Fe-4S]簇。为了确定哪些半胱氨酸参与了[3Fe-4S]簇的形成,我们将BlsK氨基酸序列中的9个半胱氨酸残基逐一突变成丝氨酸,发现C236S、C253S和C259S突变体蛋白变成无色,说明[3Fe-4S]簇被破坏;EPR分析检测突变体蛋白[3Fe-4S]簇特征信号消失,但却有Fe3+的信号,说明它们能螯合部分铁离子,但是无法形成完整的[3Fe-4S]簇。生化活性检测发现,突变体C236S、C253S和C259S催化蛋白生成LDBS的能力消失,而圆二色谱分析显示它们的二级结构和野生型蛋白整体相似,表明蛋白活性消失是由于[3Fe-4S]簇不完整导致的。当用不含有亚铁离子的M9培养基过表达BlsK时,蛋白都在沉淀中,这说明铁离子是BlsK正确折叠所必需的。在还原剂连二亚硫酸钠（DT）存在时,[3Fe-4S]1+被还原成[3Fe-4S]0,BlsK会催化产生一个新的不稳定的化合物,其结构还需进一步确定。前期工作中,WJ2缺失blsL基因后不再产生BS,积累的中间产物是DBS和少量LDBS。本研究发现,体外纯化的BlsL不能将DBS转化生成BS,而LDBS却能被高效地转化为LBS。我们测定了BlsL对这两个底物的酶动力学参数,发现BlsL对LDBS（Km≈106.8μM）的亲和力是DBS（Km≈304.8μM）的约3倍,但是BlsL对LDBS催化效率(kcat/Km≈1.475×10-22 mM-1S-1)是DBS(kcat/Km≈2.25×10-66 mM-1S-1)的约6556倍,这说明LDBS是BlsL真正的底物。它的亮氨酰基团对酶的催化活性有很大的影响,底物和酶的共晶结构或许能够解释活性上的差异。因此,这三个中间体与BS之间的转换关系为:BlsK催化亮氨酰基团加载到DBS生成LDBS后,BlsL催化加载一个甲基基团生成LBS,PepN再将亮氨酰基团水解,生成终产物BS。因为氨肽水解酶PepN水解LDBS生成DBS的效率和水解LBS生成BS的效率几乎一致,所以blsL基因缺失后,菌株积累的是大量的DBS而不是LDBS。本文通过对BS生物合成过程中BlsK和BlsL的系统研究,确证了BlsK是负责在DBS上加载亮氨酸生成LDBS的蛋白,它是一个亮氨酰tRNA依赖的氨酰基转移酶。BlsK蛋白中含有一个[3Fe-4S]簇,该[3Fe-4S]簇不仅与蛋白活性相关,而且在维持蛋白正确折叠上起作用。确认了BlsL是一个SAM依赖的甲基转移酶,它的底物是LDBS而非DBS,说明BlsK将DBS转化成LDBS不仅降低了毒性,也为BlsL提供了底物。总之,我们的研究揭示了BS合成途径中最后几个代谢产物DBS、LDBS和LBS合成的先后顺序以及它们之间的转化关系,完善了BS的生物合成途径。