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化石燃料资源的大量消耗和不可再生产生了很多问题,诸如油价高企、能源紧缺、环境污染等。而在可持续发展和节能减排的政策背景下,借助合成生物学中的方法,利用酶工程和代谢工程技术,生产可替代化石燃料的绿色燃料-生物燃料,是势在必行的趋势。作为传统液态化石燃料的重要组成成分,实现脂肪烃的生物合成具有重要意义。由P450脂肪酸脱羧酶催化的中长链(C12-C20)脂肪酸脱羧反应生成的α烯烃是一种独特的微生物天然产物,因其在生物燃料和生物材料领域的潜在应用前景倍受关注。围绕以上设想,本研究通过对脂肪酸水解酶和P450脂肪酸脱羧酶进行融合表达、纯化和酶学表征,在本研究中成功通过将脂肪酶T1L的甘油三酯水解活性与P450脱羧酶OleTJE的脂肪酸脱羧活性偶联,实现了将油脂原料两步高效转化为α烯烃。在本研究中,通过对融合蛋白中组成部件及组氨酸标签的位置进行排列组合,成功构建四种结构的质粒:pET28b-his-TlL-O1eTJE、pET28b-TlL-O1eTJE-his、pET28b-his-O1eTJE-TlL 和 pET28b-O1eTJE-TlL-his;转化至大肠杆菌 E.co/i BL21(DE3),经由IPTG诱导表达,实现四种不同结构的融合蛋白的表达。其中两种结构为his-OleTJE-TlL和his-TlL-OleTJE的融合蛋白,经镍柱层析纯化后成功实现双功能活性。其中,his-OleTJE-TlL和his-TlL-OleTJE水解十四酸甘油三酯产酸率分别为21.3%和19.5%,脂肪酸脱羧产烃率为62.3%和15.1%。融合蛋白his-OleTJE-TlL明显具有更高催化活性。以十四脂肪酸甘油三酯为底物,经气相色谱分析,融合蛋白his-OleTJE-TlL催化甘油三酯顺序水解—脱羧偶联反应的产烃率最高,达到31.7%,并且催化效率相对于双酶混合体系明显提升。两种酶混合体系催化甘油三肉豆蔻酸酯产酸率为3.3±0.3%,同等条件下FusC产酸率为14.8±1.9%;在脱羧活性试验中,双酶混合体系催化肉豆蔻酸产1-十三烯,产率为29.9±3.3%,同等条件下FusC催化肉豆蔻酸产烃率为61.2±3.9%。进行一步产烃的体外实验,实验结果表明FusC能够催化水解和脱羧反应同时进行,并且由于底物通道效应催化产烃效率明显提升,两种酶混合体系催化产烃率为14.7±1.1%,FusC为31.7±2.9%。若两种酶分步进行反应,需大于9小时的反应时长才可达到32.7±1.4%的产烃率,而FusC仅需3小时便可达到同等结果。证明融合蛋白his-OleTJE-TlL具有良好的底物通道效应。增加十二酸甘油三酯和十六酸甘油三酯为底物,考察双酶混合体系和融合蛋白his-OleTJE-TlL两种系统的底物范围。两种酶混合体系催化三月桂酰甘油酯,三肉豆蔻酸甘油三脂和软脂酸甘油酯产烃率为18.3±2.1%、14.7±1.1%和8.46±0.3%,而FusC为28.1±4.1%、31.7±2.9%和26.6±0.4%。实验表明融合蛋白较双酶混合系统,催化效率提升2倍,证明融合蛋白具有宽泛的底物选择范围,并且对不同底物均具有高催化效率,具有潜在的实际应用前景为了近一步降低酶纯化制备的成本,且基于前期关于脂肪酶以分泌蛋白形式在毕赤酵母中成功表达的研究,选择毕赤酵母为宿主菌株,通过将密码子优化后的融合蛋白TlL-OleTJE基因整合进毕赤酵母基因组,经由甲醇诱导表达,但并未得到融合蛋白,正在对融合蛋白在毕赤酵母中的转录表达情况进行研究。