论文部分内容阅读
角膜上皮细胞为可快速再生的复层扁平上皮,角膜上皮的稳态对于维持眼表的完整性以及正常的视功能具有重要意义,而拥有强大增生潜力的上皮祖细胞(包括角膜缘上皮干细胞及瞬时扩增细胞)对于维持角膜上皮的稳态起着关键性作用。Schofield等首次提出了干细胞龛的概念,假设角膜缘局部微环境中的内源性和外源性因子可以调控角膜上皮干细胞,从而促进细胞增生、并抑制其终末分化。关于角膜上皮干细胞和干细胞龛的研究已成为眼科学的热点研究领域。目前,人及兔角膜上皮细胞的培养方法已比较成熟完善,但小鼠角膜上皮细胞的培养仍为世界性难题。迄今为止,仅Hazlett等曾使用组织块培养法培养小鼠角膜上皮细胞,但仅可传至第3代,有限的生命周期、不足的细胞产量、以及迅速的细胞分化,在很大程度上阻碍了该方法在实际研究中的应用。除Hazlett外,仅最近Kawakita等采用悬浮细胞培养法成功建立一小鼠角膜上皮细胞系,但他们使用了超过200只鼠眼。据我们所知,目前仅有的两种培养方法均不能长期培养同一个体来源的小鼠角膜上皮细胞。随着转基因技术及基因敲除技术的发展,出现了种类众多的表达不同角膜上皮细胞表型的转基因鼠及基因敲除鼠,为我们进一步在分子水平上研究角膜上皮干细胞及干细胞龛提供了强大的工具。所以,建立来源于同一个体的小鼠角膜上皮细胞的成熟培养体系成为亟待解决的迫切问题。因此,本实验从干细胞培养的角度出发,以同一个体来源的小鼠角膜上皮细胞为研究对象,在比较不同的培养方法和不同的培养基的基础上,根据各培养时期的生长特点,优化培养条件,以建立成熟的小鼠角膜上皮细胞的长期培养体系。在此基础上,以培养的小鼠角膜上皮细胞为研究对象,利用RT-PCR、免疫荧光染色、Western Blotting等研究方法,分别在RNA水平和蛋白水平,对不同培养条件下的小鼠角膜上皮细胞的祖细胞标记(p63和角蛋白19抗体)及分化标记(involucrin和角蛋白12)的表达情况进行研究,进一步明确培养的小鼠角膜上皮细胞的分化表型和分化特征,为小鼠角膜上皮干细胞和干细胞龛的研究提供试验支持和理论依据。为构建组织工程化小鼠角膜上皮,本研究首创性地提出了3T3复式滋养层培养的方法,对不同的三维培养系统(3T3接触滋养层培养、3T3分离滋养层培养、3T3复式滋养层培养和无滋养层培养)进行比较研究,以创建更接近活体角膜上皮的理想模型,用于角膜干细胞和干细胞龛的研究,并探索构建组织工程化角膜上皮的最优方案。材料与方法第一部分小鼠角膜上皮干细胞的长期培养通过比较SHEM培养液中悬浮细胞培养法、KSFM培养液中悬浮细胞培养法、SHEM培养液中组织块培养法培和KSFM培养液中组织块培养法等4种培养方法,进行小鼠角膜上皮细胞的原代培养。在第四代(P4)前,小鼠角膜上皮细胞半融合或复层化后,以1:3的比例传代。从P5开始,细胞半融合后以5×10~4/75CM~2培养瓶的接种密度进行培养。在整个培养过程中,始终保持不同个体来源的细胞相互分离培养。并测定克隆形成率(Colony Forming Efficiency,CFE)、群体倍增值(Population Doublings,PDs)、群体倍增时间(Doubling Times,Tds)及绘制生长曲线。第二部分小鼠角膜上皮细胞的表型鉴定及诱导分化利用RT-PCR、Western Blotting和免疫细胞化学方法,以培养的小鼠角膜上皮细胞为研究对象,测定角膜上皮祖细胞标记p63和角蛋白19以及分化标记蛋白角蛋白12和Involucrin的表达,进行细胞表型鉴定。并分别在KSFM、含0.9mM钙离子的KSFM、含10%胎牛血清(FBS)的KSFM,含10%FBS及0.9mM钙离子的KSFM和含10%FBS的DMEM/F12五种培养基中进行分化的诱导,并进行细胞表型鉴定。第三部分组织工程化小鼠角膜上皮的构建采用气液界面法,分别在无滋养层、3T3分离滋养层、3T3接触滋养层和3T3复式滋养层4种培养体系下进行组织工程化小鼠角膜上皮的构建,并进行组织切片HE染色和免疫荧光染色,进行比较研究。结果一、小鼠角膜上皮细胞的长期培养:在低钙、无血清的KSFM培养液中,采用组织块培养法,并从干细胞的角度出发,在培养的不同阶段进行相应的优化,小鼠角膜上皮细胞可长期培养,目前已传代至P25。二、克隆形成率(CFE)及细胞生长动力学特征:1、CFE:从P5的9.7±2.6%增加至P20的29.0±3.3%(n=3)。2、群体倍增时间(Tds):随着细胞的传代,Tds逐渐减少,在P12时达到平台期,此时Tds平均为45.9±2.4小时(n=6)。到达平台期后,以700个细胞╱CM~2播种的细胞可于8天左右达到密度饱合。3、群体倍增数(PDs):细胞可成功传至P25,此时细胞倍增98.8±1.0次(n=6)。三、培养的小鼠角膜上皮细胞的表型鉴定:角膜上皮细胞表现为祖细胞表型,表达祖细胞标记p63和角蛋白19。四、培养的小鼠角膜上皮细胞的诱导分化:在含0.9mM的钙离子培养液中或含血清的培养液中,小鼠角膜上皮细胞可被诱导分化,细胞形态增大、扁平状,分化标记Involucrin表达增加,且该细胞对血清更为敏感。五、组织工程化小鼠角膜上皮的构建无论有无滋养层细胞的存在,小鼠角膜上皮细胞均可形成组织工程化角膜上皮。且在3T3复式滋养层培养时,形成的上皮细胞层数最多。结论1、在低钙、无血清的KSFM培养液中,采用组织块培养法,并从干细胞的角度出发,在培养的不同阶段进行相应的优化,小鼠角膜上皮细胞可长期培养。2、在KSFM培养液中培养的小鼠角膜上皮细胞为角膜上皮祖细胞表型。3、培养的小鼠角膜上皮细胞可被钙离子和血清诱导分化,拥有一定的分化潜力。4、培养的小鼠角膜上皮细胞可构建组织工程化小鼠角膜上皮。5、3T3滋养细胞复式培养法为构建组织工程化角膜上皮细胞的最佳选择。