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研究目的1.本研究通过观察额尔敦-乌日勒对视网膜缺血再灌注损伤大鼠神经节细胞的保护作用,阐明额尔敦-乌日勒对视网膜缺血再灌注损伤性疾病的防治作用及其可能机制。2.制备RIRI大鼠模型,观察额尔敦-乌日勒对RIRI病理学变化,对视网膜组织钙含量、神经营养因子及视网膜组织相关基因的mRNA和蛋白表达的影响,从而探讨RIRI性疾病的作用机制,为临床应用与研究提供实验依据。研究方法1.动物筛选及分组:购入健康清洁级SD大鼠127只,雌雄各半,体重为280±20g,在实验室习惯性饲养一周后开始试验。根据随机数字表法将大鼠随机分为正常组,模型组,额尔敦-乌日勒(低浓度、中浓度、高浓度)组和原花青素对照组,通过细胞凋亡实验后额尔敦-乌日勒组选择一种浓度进行机制研究。2.RIRI大鼠模型的复制:用10%水合氯醛0.35mL/100g腹腔内注射麻醉成功后,将大鼠固定于固定板上,双眼进行造模,滴托吡卡胺滴眼液散瞳后滴盐酸丙美卡因滴眼液眼表面麻醉,将连有无菌0.9%氯化钠溶液输液瓶的小孩儿头皮针刺入大鼠眼前房,避免损伤虹膜及晶状体,然后输液瓶缓慢升高150cm处,眼内形成110mmHg(14.67kpa)(1kpa=7.5mmHg)左右的眼内压,此压力接近大鼠体循环收缩压。能够造成视网膜血流阻断,1h之后又缓慢降低输液瓶高度,降低眼压,虹膜及球结膜颜色迅速恢复正常,大鼠视网膜呈橘红色,说明缺血再灌注损伤模型成功建立。3.给药方法:将珍宝丸用开水浸泡、捣碎做混悬液备用。分正常组、模型组、蒙药珍宝丸组(高剂量0.81g/kg、中剂量0.54g/kg、低剂量0.27g/kg)和中药原花青素组(0.81g/kg)。蒙药珍宝丸组和中药原花青素组1次/d,连续灌胃7d后,末次给药6h后开始造模。给药组再灌注期间也同样剂量给药。机制研究实验中额尔敦-乌日勒以0.54g/kg浓度给药至处死大鼠。4.取材与指标监测:①再灌注后24h、3d、5d和7d,以腹腔内过量注射麻醉药(10%水合氯醛)待大鼠处死后,立即摘取眼球,保留视神经大约1-2mm;置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PH=7.4)内4度固定,脱水,常规石蜡包埋,HE染色观察视网膜组织病理学改变和TUNEL方法检测神经节细胞的凋亡。②造模后7天,用10%水合氯醛深度麻醉大鼠后,腹腔动脉采血3～4ml,3000r/min离心15min,取血清,利用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血清BDNF和bFGF水平。③造模24h和7d后,麻醉大鼠待大鼠处死后,迅速摘取眼球后显微镜下剥离视网膜组织,放入EP管,投入液氮罐,后转移-80℃冰箱,分光光度计检测视网膜组织钙含量,RT-PCR法检测GFAP mRNA及Western Blot法检测GFAP蛋白表达。5.统计学处理:采用SPSS20.00软件进行统计分析,数据以均数±标准差表示,多个样本均数比较采用重复测量数据的方差分析,组间两两比较采用LSD比较,P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.额尔敦-乌日勒对RIRI大鼠视网膜组织病理学变化的影响正常组大鼠视网膜结构清晰,神经节细胞排列紧密,细胞核边缘清楚,细胞体积较大,呈圆形或椭圆形,内外核层细胞排列均匀整齐。神经节细胞层未见炎症细胞侵润。RIR 24h后,视网膜水肿,组织疏松、排列紊乱,细胞核浓缩及大量炎症细胞的侵润神经节细胞层。RIR 72h后,视网膜水肿减轻,细胞排列较前紧密,神经节细胞层炎症细胞明显增多。RIR 5d和7d后,视网膜水肿明显消退,视网膜厚度变薄,以内核层及内丛状层厚度降低最为明显,多细胞呈现空泡及核浓缩现象。经治疗后,大鼠视网膜组织学变化趋势与模型组相似,水肿,丛状层疏松程度较轻,核浓缩细胞较少,治疗7d后,凋亡细胞数明显减少及视网膜厚度变薄程度均较模型组轻。2.额尔敦-乌日勒对RIRI大鼠视网膜组织细胞凋亡的影响采用TUNEL方法对视网膜细胞凋亡情况进行检测,RIR损伤后,各实验组TUNEL标记的细胞大部分出现在内层视网膜的神经节细胞层及内核层。与模型组相比,四个治疗组在24h、3d、5d和7d四个时间点凋亡细胞阳性率均降低,其中治疗RIR 24h后,与模型组比较,额尔敦-乌日勒低剂量组、额尔敦-乌日勒中剂量组和原花青素组凋亡细胞阳性率降低,具有显著性差异(P<0.05);治疗RIR 3d后,与模型组比较,额尔敦-乌日勒中剂量组和原花青素组凋亡细胞阳性率降低,具有显著性差异(P<0.05);治疗组RIR 5d后,与模型组比较,额尔敦-乌日勒低剂量组和原花青素组凋亡细胞阳性率降低,具有显著性差异(P<0.05);治疗组RIR 7d后,与模型组比较,额尔敦-乌日勒中剂量组凋亡细胞阳性率降低,具有显著性差异(P<0.05)。蒙药额尔敦-乌日勒三组与原花青素组之间没有显著性差异(P>0.05)。3.额尔敦-乌日勒对RIRI大鼠视网膜组织Ca2+含量的影响大鼠RIR损伤24h后,与正常组比较,模型组视网膜组织钙含量明显提高(P<0.01);与模型组比较,原花青素组钙含量明显降低(P<0.05);蒙药额尔敦-乌日勒组和原花青素组之间没有显著性差异(P>0.05)。4.额尔敦-乌日勒对RIRI大鼠血清神经营养因子BDNF和bFGF的影响4.1对bFGF的影响大鼠RIR损伤7d后,与正常组比较,模型组血清bFGF水平明显提高(P<0.05);与模型组比较,原花青素组和蒙药额尔敦-乌日勒组血清bFGF水平明显提高(P<0.05);与蒙药额尔敦-乌日勒组比较,原花青素组血清bFGF水平明显提高(P<0.05)。4.2对BDNF的影响大鼠RIR损伤7d后,与正常组比较,模型组血清BDNF水平明显降低,具有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,原花青素组和蒙药额尔敦-乌日勒组血清BDNF水平明显提高(P<0.05);原花青素组和蒙药额尔敦-乌日勒组之间没有显著性差异(P>0.05)。5.额尔敦-乌日勒对RIRI大鼠视网膜组织GFAP的影响5.1RT-PCR结果:大鼠RIR损伤7d后,与正常组比较,模型组GFAPmRNA水平明显提高,具有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,原花青素组和蒙药额尔敦-乌日勒组GFAPmRNA水平明显降低,具有显著性差异(P<0.01);治疗7d后,与蒙药额尔敦-乌日勒组比较,原花青素组GFAP mRNA水平明显降低(P<0.05)。5.2 Western Blot结果:大鼠RIR损伤7d后,与正常组比较,模型组GFAP蛋白水平明显提高,具有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,原花青素组和蒙药额尔敦-乌日勒组GFAP蛋白水平明显降低,具有显著性差异(P<0.01);治疗7d后,与蒙药额尔敦-乌日勒组比较,原花青素组GFAP蛋白水平明显降低(P<0.05)。结论1.TUNEL凋亡检测结果显示额尔敦-乌日勒0.54g/kg浓度对视网膜神经节细胞凋亡效果明显,能有效抑制细胞凋亡,为RIRI机制研究提供了给药剂量。2.额尔敦-乌日勒可显著降低RIR损伤大鼠视网膜组织钙含量,保护视网膜神经节细胞的作用。3.额尔敦-乌日勒能够提高RIR损伤大鼠血清神经营养因子BDNF和bFGF的活性,对视网膜缺血再灌注损伤引起的神经节细胞具有保护及再生作用。4.额尔敦-乌日勒可降低RIR损伤大鼠视网膜组织GFAPmRNA及蛋白的表达,保护视网膜组织结构及功能的作用,并且刺激神经营养因子分泌和合成,从而保护视网膜缺血再灌注损伤作用。