目的:探索地五养肝胶囊对Solt-Farber二步法肝癌大鼠肝癌组织DNA甲基化的影响,从影响DNA甲基化层面研究其多靶点、多维度、多途径发挥防治肝癌的疗效机制;进一步研究地五养肝胶囊影响单个基因DNA甲基化可能触发的疗效机制。将整体与局部相结合,为地五养肝胶囊影响DNA甲基化进而改善肝癌肝再生微环境以防治肝癌发生与发展提供实验依据。方法:雄性SPF级SD大鼠,48只,4-5周龄,体重(150±50)g。按随机数字法将大鼠分为正常组(Normal)、模型组(Model)、地五养肝胶囊治疗组(DWYG),每组16只。使用Solt-Farber二步法复制肝癌大鼠模型,地五养肝胶囊治疗组大鼠给予地五养肝胶囊750mg/kg/d灌胃处理,正常组及模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃处理,连续干预16周后收集肝癌组织样本。使用DNA甲基化芯片分析模型组、地五养肝胶囊治疗组及正常组大鼠肝癌组织DNA甲基化变化情况,运用GO及PATHYWAY综合分析,探索肝癌发生与发展进程中肝癌组织生物学过程(BP)、细胞组份(CC)、分子功能(MF)及信号途径的变化特点,进一步研究地五养肝胶囊通过影响肝癌组织DNA甲基化发挥的多维疗效作用。运用MeDIP-PCR技术检测实验大鼠肝癌组织中差异DNA甲基化基因ADCK2甲基变化情况,Western Blot及荧光定量PCR检测实验大鼠肝癌组织中ADCK2表达情况。利用Hep3B及HuH7肝癌细胞系开展细胞学实验,将细胞系对应的分为空白对照组(Control)、5-氟尿嘧啶组(5-Fu)及地五养肝胶囊组(DWYG),地五养肝胶囊处理浓度为50μg/mL,5-氟尿嘧啶处理浓度为5μg/mL,干预处理时间为24h,采用CCK8试剂盒检测各组Hep3B及HuH7肝癌细胞系增殖情况,Transwell及划痕实验检测各组Hep3B及HuH7肝癌细胞系迁移与侵袭情况,Western Blot及荧光定量PCR检测Hep3B及HuH7肝癌细胞系中ADCK2表达情况;构建pcDNA3.1-ADCK2干扰质粒,将Hep3B及HuH7肝癌细胞系对应的分为空白对照组(Control)、地五养肝胶囊组(DWYG)及地五养肝胶囊+pcDNA3.1-ADCK2组(DWYG+pcDNA3.1-ADCK2),干预处理时间为24h,Transwell及划痕实验检测各组Hep3B及HuH7肝癌细胞系迁移与侵袭情况,免疫荧光及荧光定量PCR在Hep3B及HuH7肝癌细胞系中检测HIF-1α表达情况。结果:各组实验肝癌大鼠肝癌组织样本提取DNA质量控制合格,共沉淀DNA符合甲基化芯片扫描要求,DNA甲基化芯片扫描数据质量控制合格,在基因启动子甲基化差异分析中,模型组与正常组比较共2422个基因启动子存在甲基化差异,其中高甲基化948个(HCP类197个、ICP类284个、LCP类467个),低甲基化1474个(HCP类995个、ICP类295个、LCP类184个),这些差异的基因启动子甲基化参与了肝癌的发生与发展;地五养肝胶囊治疗组与模型组比较共1650个基因启动子存在甲基化差异,其中高甲基化935个(HCP类588个、ICP类219个、LCP类128个),低甲基化715个(HCP类216个、ICP类186个、LCP类313个),这些差异的基因启动子甲基化区域极有可能是地五养肝胶囊通过影响DNA甲基化阻断肝癌发生及发展的作用靶点。肝癌模型组大鼠与正常组差异启动子甲基化基因GO分析发现,模型组大鼠肝癌组织DNA甲基化变化主要反映在免疫反应过程、细菌来源分子反应及生物刺激应激等生物学过程;在氧化还原酶活性、分子功能调节及蛋白质二聚体活性等分子功能方面与正常组大鼠明显不同,同时质膜受体复合体、内质网膜及T细胞受体复合物等细胞组份也明显存在差异。这些差异的生物学过程、分子功能及细胞组份变化参与了肝癌的发生与发展进程。地五养肝胶囊治疗组大鼠与模型组差异启动子甲基化基因GO分析发现,地五养肝胶囊对Solt-Farber肝癌大鼠肝癌组织DNA甲基化的影响主要在细胞代谢过程、细胞定位及细胞器组织活动等生物学过程;在蛋白质结合、核糖核苷酸结合及离子通道结合等分子功能方面与模型组大鼠明显不同,同时细胞器结合膜、细胞质及细胞器等细胞组份也明显存在差异。这些差异的生物学过程、分子功能及细胞组份变化有可能是地五养肝胶囊防治肝癌的疗效机制之一。肝癌模型组大鼠与正常组差异启动子甲基化基因PATHWAY分析发现,模型组大鼠在造血细胞信号途径、类固醇激素生物合成通路、Th1和Th2细胞分化通路、Toll样受体信号通路、硒复合与代谢通路及维甲酸代谢通路等信号途径与正常组大鼠存在明显差异,这些由DNA甲基化变化引起的差异信号途径参与肝癌发生与发展过程。地五养肝胶囊治疗组大鼠与模型组差异启动子甲基化基因PATHWAY分析发现,地五养肝胶囊治疗组大鼠在钙离子信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、癌症信号通路、细胞脂肪调节信号通路及HIF-1信号通路等信号途径与模型组大鼠存在明显差异,这些差异的信号途径可能是地五养肝胶囊通过影响DNA甲基化进而发挥防治肝癌的疗效途径。Western Blot及实时荧光定量PCR检测实验大鼠肝癌组织ADCK2表达情况,模型组中ADCK2蛋白表达(0.3867±0.0893)明显高于正常组(0.1724±0.6863),地五养肝胶囊治疗组ADCK2蛋白表达降低(0.1031±0.0513),与模型组比较差异具有统计学意义(p<0.05);同样,模型组中ADCK2 mRNA表达(4.0800±0.2126)高于正常组(0.8500±0.0987),地五养肝胶囊治疗组ADCK2 mRNA表达降低(2.3860±0.2601),经统计学分析,与模型组比较差异有统计学意义(p<0.05)。地五养肝胶囊干预治疗可降低实验大鼠肝癌组织ADCK2蛋白和mRNA表达。MeDIP-PCR检测肝癌大鼠肝组织ADCK2甲基化水平结果提示,模型组ADCK2甲基化水平(25.7200±5.8500)低于地五养肝胶囊治疗组(77.6100±6.1560),二者比较差异具有统计学意义(p<0.05),地五养肝胶囊干预治疗可提高肝癌大鼠肝癌组织ADCK2甲基化水平。CCK8检测Hep3B及HuH7细胞系增殖情况,地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系增值率(0.5584±0.0168)低于空白对照组(0.6828±0.0137),差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.5734±0.0150)比较差异无统计学意义(p>0.05);地五养肝胶囊处理组HuH7细胞系增值率(0.6034±0.0162)低于空白对照组(0.7696±0.0181),差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.6354±0.0055)比较差异无统计学意义(p>0.05)。Transwell实验结果提示,地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系迁移细胞数(65.4000±7.9870)低于空白对照组细胞迁移数(106.4000±8.5030),差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(63.6000±4.0990)比较差异无统计学意义(p>0.05);地五养肝胶囊处理组HuH7细胞系迁移细胞数(11.8000±2.4900)低于空白对照组细胞迁移数(25.2000±8.4970),差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(14.2000±2.5880)比较差异无统计学意义(p>0.05)。细胞划痕实验结果提示,地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系相对迁移率(0.4265±0.0056)低于空白对照组(0.6919±0.0389),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.4378±0.0207)比较差异无统计学意义(p>0.05);同样地五养肝胶囊处理组HuH7细胞系相对迁移率(0.1710±0.0673)低于空白对照组(0.2597±0.0555),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.1905±0.0816)比较,差异无统计学意义(p>0.05)。实时荧光定量PCR检测Hep3B细胞系中ADCK2 mRNA表达,结果提示地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系ADCK2 mRNA表达(0.5167±0.0305)低于空白对照组(1.0100±0.0854),差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.4767±0.0305)比较差异无统计学意义(p>0.05);在HuH7细胞系中,地五养肝胶囊处理组ADCK2 mRNA表达(0.5033±0.0057)同样低于空白对照组(1.1100±0.1249),差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.5233±0.0907)比较差异无统计学意义(p>0.05)。Western Blot检测Hep3B细胞系中ADCK2蛋白表达,地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系ADCK2蛋白表达(0.0995±0.0224)低于空白对照组(0.5288±0.0187),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.1008±0.0158)比较差异无统计学意义(p>0.05);地五养肝胶囊处理组HuH7细胞系ADCK2蛋白表达(0.0977±0.0186)低于空白对照组(0.5209±0.0350),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),与5-氟尿嘧啶组(0.0927±0.0239)比较差异无统计学意义(p>0.05)。Transwell实验结果提示,地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系迁移细胞数(54.1100±7.3560)低于对照组细胞迁移数(107.6000±6.7660),差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒后地五养肝胶囊+pcDNA3.1-ADCK2处理组细胞迁移数增加(70.4400±6.0440),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05);地五养肝胶囊处理组HuH7细胞系迁移细胞数(16.3300±2.5980)低于对照组细胞迁移数(38.0000±4.6900),差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒后地五养肝胶囊+pcDNA3.1-ADCK2处理组细胞迁移数增加(25.6700±3.6060),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。细胞划痕实验结果提示,地五养肝胶囊处理组Hep3B细胞系相对迁移率(0.2547±0.0030)低于对照组(0.6833±0.0211),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒后地五养肝胶囊+pcDNA3.1-ADCK2处理组相对迁移率增加(0.4250±0.0045),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05);同样地五养肝胶囊治疗组HuH7细胞系相对迁移率(0.1746±0.0479)低于对照组(0.2642±0.0532),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒后地五养肝胶囊+pcDNA3.1-ADCK2处理组相对迁移率增加(0.2258±0.0198),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光检测Hep3b及HuH7细胞系中HIF-1α表达强度,结果提示地五养肝胶囊处理组Hep3b细胞系HIF-1α表达强度(8634.58±1457.47)明显低于对照组(23758.50±502.25),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒过表达ADCK2后,地五养肝胶囊抑制HIF-1α表达的效果被逆转(18549.81±2775.33),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05);在HuH7细胞系中五养肝胶囊处理组HIF-1α表达强度减弱(6616.14±1087.15)与对照组(15624.25±1554.99)比较差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒过表达ADCK2后,地五养肝胶囊抑制HIF-1α表达的效果被逆转(9532.74±752.45),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。实时荧光定量PCR检测Hep3b及HuH7细胞系中HIF-1αmRNA表达情况,结果提示地五养肝胶囊处理组Hep3b细胞系HIF-1αmRNA表达量降低(0.2600±0.1153)明显低于对照组(1.047±0.2631),经比较差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒过表达ADCK2后,地五养肝胶囊抑制HIF-1αmRNA表达的效果被逆转(0.5700±0.0435),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05);在HuH7细胞系中五养肝胶囊处理组HIF-1αmRNA表达强度减弱(0.1967±0.0321)与对照组(1.077±0.0929)比较差异具有统计学意义(p<0.05),导入pcDNA3.1-ADCK2质粒过表达ADCK2后,地五养肝胶囊抑制HIF-1αmRNA表达的效果被逆转(0.6400±0.1179),与地五养肝胶囊处理组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:地五养肝胶囊可影响Solt-Farber肝癌大鼠肝癌组织DNA甲基化,发挥多靶点、多维度、多途径防治肝癌发生与发展的疗效作用。地五养肝胶囊抑制Hep3b及HuH7肝癌细胞系增殖、迁移与侵袭。地五养肝胶囊阻断肝癌发生与发展的作用机制之一可能是通过提高Solt-Farber肝癌大鼠肝癌组织ADCK2基因甲基化程度,降低ADCK2在Solt-Farber肝癌大鼠肝癌组织及Hep3b及HuH7肝癌细胞系中的表达强度,并通过降低ADCK2表达抑制缺氧诱导因子HIF-1α表达,进而抑制缺氧压力下肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力,改善肝癌细胞缺氧压力诱导的恶性再生状态,阻断肝癌肝再生微环境持续恶化发挥其防治肝癌发生与发展的治疗作用。