乌昌地区主要鱼类致病菌的分离、鉴定及生物学特性研究

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目的:新疆地域辽阔,水系特殊,随着“丝绸之路经济带”的建设,本地经济呈蓬勃上升趋势,乌昌地区水产养殖业发展更为迅速。河鲈、金鳟、虹鳟、美洲红点鲑、西伯利亚鲟、大西洋鲑、梭鲈等冷水性鱼类以及锦鲤、银龙、鲫鱼、加州鲈等非冷水性鱼类的养殖虽起步晚,却已趋规模,但接踵而来的各种病害,特别是细菌病给养殖者造成了巨大的经济损失。本试验通过传统方法以及分子生物学方法对锦鲤、河鲈、西伯利亚鲟等发病鱼类进行了致病菌的分离与鉴定。方法:从乌昌地区部分发病渔场采集发病鱼样,并从鱼体病变处、腹水、内脏分离优势菌,通过革兰氏染色,生理生化试验等传统方法对分离菌进行初步鉴定,然后进行PCR试验,将产物进行测序,并将序列在NCBI上进行Blast比对,构建进化树,确定分离菌的种属及属内亲缘关系;对致病菌进行药敏试验,讨论该致病菌的药敏特性;对病理组织进行石蜡切片,分析致病菌对机体造成的损伤;最后通过回归感染试验,看是否能复制出相同的发病症状及病理变化。对实验室分离的32株气单胞菌进行毒力因子检测,筛选强毒株。为明确造成锦鲤(Cyprinus carpio)大批死亡的致病菌,对病鱼肝脏、肾脏等组织进行细菌分离纯化。通过革兰氏染色、微量生理生化反应及分子生物学鉴定,成功分离出两株菌,命名为CK5和CK9,结果为G-,在30°C正常生长,能利用葡萄糖、乳糖、纤维二糖,V-P、明胶、水杨苷试验阳性;PCR扩增其gyr B基因并测序,将序列Blast比对后,发现两株菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的同源性最高,分别为99.6%和99.0%,在系统发育树上与维氏气单胞菌聚为一支。病理组织切片显示肝脏脂肪空泡变性,肾小管变性坏死。药敏试验结果表明CK5、CK9对庆大霉素、氧氟沙星、头孢噻肟、氨曲南、诺氟沙星等药物敏感,对万古霉素、克林霉素、苯唑西林耐药。从发病的河鲈(Perca fluviatilis Linnaeus)肝脏、肠道分离病原菌,对分离菌进行了传代纯化培养、菌种鉴定、药敏试验以及致病性检测。人工感染结果证明分离菌具有明显致病性,结合形态观察、革兰氏染色、生理生化结果、16S r RNA序列比对和基因序列进化树分析,鉴定出ZL1株为温和气单胞菌(Aeromomas sobria),ZL3和ZL5株为迟缓爱德华菌(Edwardisella tarda)。药敏试验显示ZL1株对庆大霉素、米诺环素、头孢他啶等高度敏感,对链霉素、青霉素、克拉霉素等耐药。ZL3和ZL5株对左氧氟沙星、链霉素和恩诺沙星敏感,对庆大霉素,氨苄西林、青霉素G、复方新诺明等耐药。从发病西伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏、脾脏分离到一株优势菌命名为XB2,通过革兰氏染色、生理生化、药敏试验,对其16S r RNA基因序列进行测定,并对序列用MEGA6.0进行了分析。结果显示XB2为G-短杆菌,单独或成对出现;产酸不产气,能利用蔗糖、果糖、葡萄糖、枸橼酸(Simmons);在含3%(W/V)氯化钠中能生长,高于4%(W/V)氯化钠中不生长;4°C不生长,20~30°C都能生长,但在37°C不生长;不利用乳糖、水杨苷、纤维二糖、硫化氢、酒石酸、阿拉伯糖。进化树显示XB2与鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri,)同源性达99.0%。通过回归感染确定其LD50为2.37×104cfu/m L。药敏结果显示对氟苯尼考、左氧氟沙星、哌拉西林以及阿洛西林等9种药物敏感;对麦迪霉素、大观霉素、链霉素、氨苄西林等15种药物耐药。对实验室分离的32株气单胞菌,通过PCR扩增其hly、act、alt和aha I基因。经鉴定,初步判断有10株菌携带有强毒株基因型。
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