【摘 要】
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蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌感染蜜蜂幼虫引起的真菌性病害,是蜜蜂中发病率最高的真菌病。蜜蜂球囊菌只感染蜜蜂幼虫,导致幼虫在化蛹前死亡,造成蜂群群势下降,引起减产,影响养蜂者的收入。由于加强饲养管理不能从根本解决病害,药物治疗则容易造成药物残留,天然提取物的治疗效果有限,所以抗病育种是目前抵抗病害比较好的解决办法。前人的研究已经鉴定出蜜蜂的第2和11号染色体与蜜蜂幼虫抗白垩病相关,且从编码区筛选验证出了
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蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌感染蜜蜂幼虫引起的真菌性病害,是蜜蜂中发病率最高的真菌病。蜜蜂球囊菌只感染蜜蜂幼虫,导致幼虫在化蛹前死亡,造成蜂群群势下降,引起减产,影响养蜂者的收入。由于加强饲养管理不能从根本解决病害,药物治疗则容易造成药物残留,天然提取物的治疗效果有限,所以抗病育种是目前抵抗病害比较好的解决办法。前人的研究已经鉴定出蜜蜂的第2和11号染色体与蜜蜂幼虫抗白垩病相关,且从编码区筛选验证出了一个可以评估蜂群抗白垩病能力的SNP分子标记C2587245T。但是关于蜜蜂非编码区与幼虫抗白垩病相关SNP的研究无人涉及,而且对于已发现的C2587245T分子标记的快速检验方法也没有建立,所以本研究主要对蜜蜂非编码区与幼虫抗白垩病相关的SNP进行筛选验证,并通过dCAPS法与HRM法尝试对C2587245T位点进行基因分型,以期建立一种合适、易行、省时的基因分型方法。本研究首先培养纯化蜜蜂球囊菌并在实验室内培养蜜蜂幼虫,将培养获得的蜜蜂球囊菌孢子作为病原来对蜜蜂幼虫进行接种,从而筛选出可靠的抗病幼虫与易感病幼虫;然后通过挖掘晏励民等的重测序结果,筛选出了所有位于2和11号染色体上的蜜蜂非编码区与幼虫抗白垩病相关的SNP位点;然后针对这些SNP位点设计特异性引物,用抗病幼虫与易感病幼虫的基因组DNA进行PCR测序,初步筛选掉假阳性位点,留下候选SNP位点;之后扩大样本量,进一步检验候选的SNP位点,从中筛选可靠的蜜蜂非编码区与幼虫抗白垩病相关的SNP位点;最后还通过dCAPS法与HRM法针对之前已发现的C2587245T位点进行基因分型尝试,建立了关于该SNP位点的快速检验方法。该研究筛选并验证出位于蜜蜂第11号染色体LOC100578413基因非编码区的SNP位点SNP-11与幼虫的抗白垩病性状相关,该SNP位点在抗病幼虫样本中的T等位基因频率显著高于易感病幼虫;在对C2587245T位点的基因分型方法上,dCAPS法由于引物不能扩增出碱基为T型的模板,所以不能直接对SNP位点C2587245T用dCAPS法进行基因分型,但是可以在模板用量一致的前提下,进行间接的基因分型,当模板用量一致,C/C纯合型模板的条带亮度应该高于C/T杂合型模板条带的亮度,可以以C/C纯合DNA模板的条带为基准,亮度不及基准条带（约为基准条带亮度的1/2）的模板为C/T杂合型,无条带的模板即为TT纯合型;HRM法对SNP位点C2587245T的基因分型效果很好,荧光信号减弱最快的是C/C型模板,其次是C/T杂合型,然后是TT纯合型;同时,C/C纯合型的熔解温度最低,C/T杂合性的熔解温度介于C/C纯合与T/T纯合之间,T/T纯合型则具有最高的熔解温度。本研究的研究结果为辅助抗病育种提供了新的分子标记,也提供了针对SNP位点C2587245T的合适、易行、省时的基因分型方法,有助于进行抗白垩病蜂种的选育工作,同时也能为其他分子标记的快速检验方法建立提供参考。
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