论文部分内容阅读
THP-1人单核细胞来源于急性单核细胞性白血病患者,与人外周血中单核细胞具有一定的相似性,并可在体外进行增殖传代,是研究急性单核细胞白血病、单核巨噬细胞免疫应答能力等常用的工具细胞。因此,探究THP-1单核细胞增殖的机制对了解急性单核细胞白血病的发生、发展具有重要意义。微小RNA (miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的高度保守的非编码小分子RNA,通过与靶基因的3’-UTR结合,对靶基因进行降解或翻译抑制。miR-21是较早发现并广泛存在的miRNA之一。研究表明,在几乎所有的实体瘤及血液恶性肿瘤中miR-21均高表达,其可能发挥原癌基因的作用。本论文以THP-1人单核细胞为实验材料,利用qPCR、蛋白印迹、双荧光素酶报告基因法等实验方法对其增殖机制进行了研究。首先,通过慢病毒感染的方法建立了 miR-21过表达/抑制THP-1稳转细胞系。其次,为了探究miR-21对THP-1人单核细胞增殖的影响,采用MTT法、蛋白印迹法检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)蛋白的表达对细胞的增殖能力进行检测。再次,通过流式细胞术进一步检测miR-21对细胞周期的影响。最后,利用TargetScan软件对miR-21进行靶基因预测并采用双荧光素酶报告基因法进行验证。实验结果如下:1.利用慢病毒载体,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50感染人THP-1,2 μg/mL嘌呤霉素筛选后建立阴性对照(NC)、miR-21过表达(LV-mir-21 )、miR-21-5p inhibition (Anti-miR-21-5p)稳转 THP-1 细胞系。结果显示:与 NC组相比,LV-mir-21组的miR-21-5p的表达量上调近6倍,说明miR-21稳转THP-1人单核细胞建系成功。2. MTT法检测细胞增殖结果显示:过表达miR-21能显著促进THP-1人单核细胞的增殖,抑制miR-21-5p的表达则显著抑制细胞增殖。PCNA蛋白结果趋势与此类似。两者结果均说明miR-21-5p能显著促进THP-1单核细胞的增殖。3.流式细胞术结果显示:过表达miR-21能够促进THP-1细胞进入细胞周期的S期和G2/M期,进而促进细胞增殖;抑制miR-21-5p的表达,结果与之相反。4.通过TargetScan软件预测miR-21-5p的靶基因,并根据结合位点的保守性及预测靶基因的功能,筛选出与细胞增殖相关的基因KLF6、BCL11B作为候选靶基因。查找并构建KLF6及BCL11B的3’-UTR序列至真核表达载体psiCHECK-2 上。将其分别与 negative control/miR-21-5p mimics/miR-21-5p inhibitor共转293细胞,并进行荧光素酶活性检测。结果显示:与对照组(negative control+野生型3’-UTR)相比,BCL11B质粒的荧光素酶活性显著性降低(p<0.05 ),而KLF6质粒的荧光素酶活性没有显著性差异(p>0.05),说明BCL11B为miR-21-5p的靶基因,而KLF6不是其靶基因。蛋白印迹结果显示:miR-21的过表达导致BCL11B蛋白的表达水平极显著性降低(p<0.01),而KLF6蛋白的表达水平各组之间没有明显变化(p>0.05)。进一步说明了 BCL11B与miR-21-5p存在负向的靶向关系。综上所述,过表达miR-21可促进THP-1细胞进入细胞周期的S期和G2/M期;miR-21-5p通过靶向BCL11B促进了 THP-1单核细胞的增殖,也为探究急性单核细胞白血病发生机制提供了一定的理论依据。