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近几十年来,环境化学物质对于健康的影响受到越来越多的关注,邻苯二甲酸二丁酯(Dibutylphthalate,DBP)是一种广泛存在的环境内分泌干扰物,属邻苯二甲酸酯类,作为聚氯乙烯的增塑剂广泛应用于多种塑料制品中。邻苯二甲酸单丁酯(Monobutylphthalate,MBP)为DBP的体内代谢物。生殖器官对DBP暴露尤为敏感,包括本实验室在内的大量研究发现DBP具有生殖和发育毒性,睾丸是其主要靶器官,睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)是其重要的靶细胞。本实验室前期研究发现将分离自9天大鼠睾丸的SCs暴露于不同浓度MBP,能够引起细胞生长异常,进一步通过mRNA高通量芯片技术筛选出了低浓度MBP引起SCs增殖过程中mRNA的差异表达谱。本论文根据芯片结果分析及数据库查阅发现,E3泛素连接酶Pellino 2(Peli2)与白细胞介素-1相关受体激酶1(Interleukin-1 receptor-associatedkinase 1,IRAK1)之间存在着潜在的负调控机制。因此,本研究首先观察MBP对SCs生长及功能的影响,然后探讨了 SCs暴露不同浓度MBP后干扰Peli2表达在细胞增殖中的作用机制和MBP对SCs生长影响的相关分子机制。全文分为两部分:第一部分MBP对SCs生长及功能的影响一、目的比较不同剂量MBP暴露对SCs生长及功能的影响。二、方法1.9天大鼠睾丸SCs的分离及原代培养。2.FDA/PI 双染法检测不同浓度(Control、0.1 mM、1mM、10mM)MBP 染毒24 h后细胞的存活。3.荧光定量RT-PCR技术验证原代培养的SCs暴露低剂量(0.1 mM)MBP24h后mRNA芯片结果的可靠性。4.CCK-8法检测小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞暴露不同浓度MBP 1、2、3、4、5天后,细胞的增殖活力,绘制细胞增殖曲线。5.EdU细胞增殖试剂盒检测TM4细胞暴露不同浓度MBP 24 h后,对DNA复制的影响。6.流式细胞术检测TM4细胞暴露不同浓度MBP 24 h、48 h、72 h后细胞凋亡情况;流式细胞术检测TM4细胞暴露低浓度MBP 72 h后对细胞增殖周期的影响。7.腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)检测试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒分别检测TM4细胞暴露不同浓度MBP 24 h后细胞中ATP含量和细胞释放LDH的水平。8.TM4细胞暴露不同浓度MBP后,检测TM4细胞间紧密连接相关蛋白的表达情况,观察对SCs成熟的影响。三、结果1.光镜下可见,随着染毒浓度的增加,贴壁的SCs形态并未发生明显改变;但是0.1 mM处理组细胞数量明显增多,10 mM组细胞数量明显减少,部分细胞呈现圆形悬浮在培养基中。2.FDA/PI双染检测结果显示,随着染毒浓度的增加,SCs凋亡比例先下降后上升;细胞活性检测发现,随着染毒浓度的增加,细胞活力先升高后下降。3.将芯片中差异表达的Testin、Cryz、Peli2、Trim2、Rnf135、Cpsf2进行验证,验证结果发现Peli2、Trim2、Rnf135、Cpsf2与芯片结果一致。其中Peli2的表达变化较为显著。进一步的机制研究拟利用小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞作为研究对象。4.CCK-8法检测结果表明,随着MBP浓度升高,TM4细胞增殖活力先上升后下降,低浓度(0.1 mM)MBP促进TM4细胞增殖;高浓度(10mM)MBP明显抑制细胞生长。5.EdU细胞增殖试剂盒检测结果发现,随着MBP浓度升高,TM4细胞中DNA复制能力先上升后下降,低浓度MBP促进TM4细胞DNA复制;高浓度MBP明显抑制DNA的复制。6.流式凋亡细胞术检测结果发现,随着MBP浓度升高,TM4细胞凋亡比例先下降后上升,低浓度MBP抑制TM4细胞凋亡;高浓度MBP明显促进细胞凋亡。细胞周期检测发现,低浓度MBP显著增加S期和G2/M期比例。7.ATP检测结果发现,低浓度MBP升高细胞内ATP水平,高浓度MBP明显降低ATP水平;LDH检测结果发现,低浓度MBP使细胞LDH释放量明显降低,高浓度MBP明显升高LDH释放量。8.TM4细胞暴露低浓度MBP后,细胞间血睾屏障相关蛋白表达升高,表明MBP具有促进SCs成熟的作用:高浓度MBP染毒后,能够抑制细胞间血睾屏障相关蛋白的表达,破坏SCs成熟进程。四、结论1.低浓度MBP促进SCs增殖,高浓度MBP导致细胞凋亡。2.低浓度MBP促进SCs成熟,高浓度MBP破坏SCs成熟进程。第二部分MBP干扰SCs生长的分子机制研究一、目的探究低浓度MBP促进SCs增殖的分子机制及高浓度MBP促进SCs凋亡的分子机制。二、方法1.通过RT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术验证TM4细胞暴露MBP后Peli2的表达变化。2.通过RT-PCR、Western Blot、免疫荧光和免疫共沉淀技术检测TM4细胞暴露不同浓度(Control、0.1 mM、1 mM、10 mM)MBP 后,IRAK1 的基因水平和蛋白泛素化水平变化。通过Western Blot检测下游MAPK/JNK信号通路的激活情况,研究其对细胞增殖的影响。3.TM4细胞暴露不同浓度MBP后,检测细胞外源性凋亡信号通路即FADD/Caspase 8信号通路和内源性凋亡信号通路即Bax/Bcl-2信号通路的激活情况,研究其对细胞凋亡的影响。三、结果1.芯片验证结果发现,Peli2表达与芯片结果吻合。2.通过RT-PCR、Western Blot、免疫荧光和免疫共沉淀技术发现TM4细胞暴露低浓度(0.1 mM)MBP后,IRAK1的K63泛素化水平升高,c-Jun磷酸化水平增高,细胞增殖;TM4细胞暴露高浓度(10mM)MBP后,IRAK1的K63泛素化水平降低,c-Jun磷酸化水平降低,抑制细胞增殖。3.凋亡相关信号通路分析证实,TM4细胞暴露低浓度MBP后,FADD、cl-Caspase 8、cl-Caspase 3 表达升高;高浓度 MBP 作用后,FADD、cl-Caspase 8、cl-Caspase 3表达降低;TM4暴露低浓度MBP后,凋亡指标Bax/Bcl-2的比值降低,提示细胞内源性凋亡信号通路受到抑制;高浓度MBP升高凋亡指标Bax/Bcl-2的比值,提示内源性凋亡信号通路激活。四、结论1.低浓度MBP可以抑制Peli2的表达,IRAK1的K63泛素化水平升高,激活下游MAPK/JNK信号通路,促进SCs的增殖。2.低浓度MBP激活FADD/Caspase 8信号通路,可能与SCs增殖有关。3.高浓度MBP通过激活细胞内源性凋亡信号通路,促进SCs的凋亡。综合以上实验结果,提示我们MBP通过Peli2及下游信号通路、FADD/Caspase 8信号通路及Bax/Bcl-2信号通路干扰睾丸SCs生长,引起睾丸SCs发育异常。