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香蕉和大蕉（下文统称：香大蕉）不仅是重要的水果同时也是许多非洲国家不可或缺的食物来源。低温是影响全球香蕉产业最为严重的非生物胁迫之一。为了理解冷抗性的大蕉和冷敏感的香牙蕉抗寒差异的分子机理，采用转录组学、磷酸化蛋白质组学对大蕉的抗寒机制进行解析，同时在转录组学研究的基础上，克隆出大蕉MAPK3基因，利用成熟的转基因体系进行遗传转化，研究MAPK3基因在大蕉抗寒性方面的功能。研究结果如下：
1、ICE1以及MYBS3基因快速的激活以及选择性的诱导配合其他冷响应基因的表达可能是转录水平上大蕉抗寒性优于香牙蕉的主要原因之一。
1）比较分析大蕉和香牙蕉在冷胁迫0、3以及6 h下转录组的差异发现，相较于0 h，大蕉3 h冷胁迫后有10个基因差异显著性表达，6 h冷胁迫后有68个差异基因；而在香牙蕉中，3 h冷胁迫后的差异基因数为40个，6 h冷胁迫后的差异基因为238个；
2）Go功能分类分析发现转录组中鉴定到的大部分差异基因都属于11个类别，主要包括转录调控、逆境信号转导响应等；受到冷胁迫6 h后有17个基因只在大蕉中表现出差异，这些基因参与信号转导、非生物胁迫、铜离子平衡、光合作用与光呼吸、糖积累以及蛋白修饰等进程；
3）对包括ICE1以及MYBS3在内的12个早期响应基因进行定量PCR验证（取5个时间点，0、3、6、24以及48 h冷胁迫），结果表明这12个基因在香牙蕉和大蕉冷胁迫下表现出显著性的差异，尤其是ICE1以及MYBS3在大蕉中的表达模式与在香牙蕉中的差异尤为明显。在大蕉受到冷胁迫后，ICE1以及MYBS3基因的表达具有选择性激活的现象，因此我们认为大蕉中ICE1以及MYBS3基因快速的激活以及选择性的诱导配合其他冷响应基因的表达可能是转录水平上大蕉抗寒性优于香蕉的主要原因之一。
2、MpMAPK3可能通过影响大蕉体内的氧化还原代谢通路进而对大蕉的抗寒性起正调控的作用。
1）对干涉 MpMAPK3基因表达的转基因大蕉进行分子检测和耐寒性测试，结果发现，随着冷胁迫时间的延长，转基因植株叶片逐步出现脱水萎蔫的表型，而野生型大蕉仍能保持正常的状态，同时，转基因植株冷响应基因表达量较野生对照也发生了显著变化。
2）通过对野生型大蕉以及转基因植株磷酸化蛋白质组学的测定后发现相较于野生型大蕉，转基因植株中与氧化还原酶活性相关的31条差异表达的磷酸化多肽的磷酸化程度受到了严重的抑制，这说明MpMAPK3激酶活性的抑制可能导致转基因植株体内氧化还原代谢途径的紊乱。对丙二醛含量、POD活性的测定发现转基因植株的丙二醛含量显著高于野生对照，POD的活性在冷胁迫下响应程度也低于野生型。综上所述，MpMAPK3可能通过影响大蕉体内的氧化还原代谢通路进而对大蕉的抗寒性起着正调控的作用。
3、大蕉中的MKK2互作网络结合其他特异性响应冷胁迫的磷酸化蛋白的功能可能是大蕉在磷酸化水平上抗寒性优于香牙蕉的重要原因。
1）对香牙蕉和大蕉冷胁迫下磷酸化蛋白质组学数据分析发现，在香牙蕉冷胁迫磷酸化蛋白质组学中共鉴定到679条磷酸化多肽，其中源于147个磷酸化蛋白的180条磷酸化多肽在冷胁迫3 h后表现出差异显著性变化；在大蕉中鉴定到的241条磷酸化多肽中有83条多肽（属于63个磷酸化蛋白）表现出差异显著性变化。
2）对差异蛋白进行互作网络预测分析后发现有5个磷酸化蛋白参与到了以mitogen-activated protein kinase kinase2(MKK2)为中心的互作网络中，这五个磷酸化蛋白为 MKK2、Transcription factor HY5、calcium-sensing receptor(CaSR)、Serine/threonine-protein kinase STN7以及kinesin-like protein。以上5个蛋白所包含的9条磷酸化多肽的丰度在香牙蕉和大蕉冷响应过程中的变化存在显著性的差异。
3）对香牙蕉和大蕉悬浮细胞中MKK2蛋白以及包含其磷酸化位点T31的磷酸化多肽进行Western blotting实验发现随着冷胁迫时间的增加大蕉悬浮细胞中MKK2蛋白的丰度呈现下降的趋势，而T31磷酸化位点所在的多肽却表现出显著性的上调，该结果与磷酸化蛋白质组学数据一致；但在香牙蕉悬浮细胞中，MKK2蛋白的丰度保持稳定，而T31的磷酸化没有被检测到。以上这些结果表明大蕉中的MKK2互作网络结合其他特异性响应冷胁迫的磷酸化蛋白的功能可能是大蕉在磷酸化水平上抗寒性优于香牙蕉的重要原因。
综上所述，本研究基于转录组、磷酸化蛋白质组学以及基因功能鉴定的方法对香牙蕉和大蕉抗寒差异的分子机制进行了解析，结果将为香蕉抗寒分子育种提供理论依据和改良目标。
1、ICE1以及MYBS3基因快速的激活以及选择性的诱导配合其他冷响应基因的表达可能是转录水平上大蕉抗寒性优于香牙蕉的主要原因之一。
1）比较分析大蕉和香牙蕉在冷胁迫0、3以及6 h下转录组的差异发现，相较于0 h，大蕉3 h冷胁迫后有10个基因差异显著性表达，6 h冷胁迫后有68个差异基因；而在香牙蕉中，3 h冷胁迫后的差异基因数为40个，6 h冷胁迫后的差异基因为238个；
2）Go功能分类分析发现转录组中鉴定到的大部分差异基因都属于11个类别，主要包括转录调控、逆境信号转导响应等；受到冷胁迫6 h后有17个基因只在大蕉中表现出差异，这些基因参与信号转导、非生物胁迫、铜离子平衡、光合作用与光呼吸、糖积累以及蛋白修饰等进程；
3）对包括ICE1以及MYBS3在内的12个早期响应基因进行定量PCR验证（取5个时间点，0、3、6、24以及48 h冷胁迫），结果表明这12个基因在香牙蕉和大蕉冷胁迫下表现出显著性的差异，尤其是ICE1以及MYBS3在大蕉中的表达模式与在香牙蕉中的差异尤为明显。在大蕉受到冷胁迫后，ICE1以及MYBS3基因的表达具有选择性激活的现象，因此我们认为大蕉中ICE1以及MYBS3基因快速的激活以及选择性的诱导配合其他冷响应基因的表达可能是转录水平上大蕉抗寒性优于香蕉的主要原因之一。
2、MpMAPK3可能通过影响大蕉体内的氧化还原代谢通路进而对大蕉的抗寒性起正调控的作用。
1）对干涉 MpMAPK3基因表达的转基因大蕉进行分子检测和耐寒性测试，结果发现，随着冷胁迫时间的延长，转基因植株叶片逐步出现脱水萎蔫的表型，而野生型大蕉仍能保持正常的状态，同时，转基因植株冷响应基因表达量较野生对照也发生了显著变化。
2）通过对野生型大蕉以及转基因植株磷酸化蛋白质组学的测定后发现相较于野生型大蕉，转基因植株中与氧化还原酶活性相关的31条差异表达的磷酸化多肽的磷酸化程度受到了严重的抑制，这说明MpMAPK3激酶活性的抑制可能导致转基因植株体内氧化还原代谢途径的紊乱。对丙二醛含量、POD活性的测定发现转基因植株的丙二醛含量显著高于野生对照，POD的活性在冷胁迫下响应程度也低于野生型。综上所述，MpMAPK3可能通过影响大蕉体内的氧化还原代谢通路进而对大蕉的抗寒性起着正调控的作用。
3、大蕉中的MKK2互作网络结合其他特异性响应冷胁迫的磷酸化蛋白的功能可能是大蕉在磷酸化水平上抗寒性优于香牙蕉的重要原因。
1）对香牙蕉和大蕉冷胁迫下磷酸化蛋白质组学数据分析发现，在香牙蕉冷胁迫磷酸化蛋白质组学中共鉴定到679条磷酸化多肽，其中源于147个磷酸化蛋白的180条磷酸化多肽在冷胁迫3 h后表现出差异显著性变化；在大蕉中鉴定到的241条磷酸化多肽中有83条多肽（属于63个磷酸化蛋白）表现出差异显著性变化。
2）对差异蛋白进行互作网络预测分析后发现有5个磷酸化蛋白参与到了以mitogen-activated protein kinase kinase2(MKK2)为中心的互作网络中，这五个磷酸化蛋白为 MKK2、Transcription factor HY5、calcium-sensing receptor(CaSR)、Serine/threonine-protein kinase STN7以及kinesin-like protein。以上5个蛋白所包含的9条磷酸化多肽的丰度在香牙蕉和大蕉冷响应过程中的变化存在显著性的差异。
3）对香牙蕉和大蕉悬浮细胞中MKK2蛋白以及包含其磷酸化位点T31的磷酸化多肽进行Western blotting实验发现随着冷胁迫时间的增加大蕉悬浮细胞中MKK2蛋白的丰度呈现下降的趋势，而T31磷酸化位点所在的多肽却表现出显著性的上调，该结果与磷酸化蛋白质组学数据一致；但在香牙蕉悬浮细胞中，MKK2蛋白的丰度保持稳定，而T31的磷酸化没有被检测到。以上这些结果表明大蕉中的MKK2互作网络结合其他特异性响应冷胁迫的磷酸化蛋白的功能可能是大蕉在磷酸化水平上抗寒性优于香牙蕉的重要原因。
综上所述，本研究基于转录组、磷酸化蛋白质组学以及基因功能鉴定的方法对香牙蕉和大蕉抗寒差异的分子机制进行了解析，结果将为香蕉抗寒分子育种提供理论依据和改良目标。