肥大细胞源胞外体在非小细胞肺癌中的作用

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目的:①探讨干细胞因子受体(KIT)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征及生存期的关系。②分析肥大细胞源胞外体对非小细胞肺癌细胞增殖与细胞周期等生物学行为的影响。③探讨肥大细胞源胞外体促进非小细胞肺癌增殖的相关机制。方法:①选取病理学确认非小细胞肺癌146例石蜡包埋组织切片,利用免疫组化标记KIT及免疫荧光原位杂交标记EGFR,分析KIT/EGFR与患者吸烟史,肿瘤累及胸膜、神经、血管、淋巴结,吸烟史,临床TNM分期和患者生存期等的相关性。②以人肥大细胞系HMC-1细胞和非小细胞肺癌细胞系A549细胞为研究对象,通过细胞摄取实验,Brd U增殖实验及PI染色研究肥大细胞来源的胞外体对非小细胞肺癌增殖及细胞周期等生物学行为的影响。③通过PCR和western blot方法检测KIT通过胞外体从肥大细胞向非小细胞肺癌细胞的转移,并进一步探讨KIT/SCF信号下游PI3K/Akt通路中相关蛋白表达变化。结果:①KIT与非小细胞肺癌患者预后有着密切的关系,KIT阳性可显著降低患者生存期(P=0.048),术后中位生存期为19个月,且与低分化(P=0.043)、吸烟(P=0.032)和累及胸膜(P=0.007)显著相关。同时本实验表明EGFR也是负性预后因素,与分化程度(P=0.023)和吸烟史(P=0.044)显著相关,但是EGFR基因拷贝数与患者的生存期无明显相关性。共表达KIT和EGFR的非小细胞肺癌患者生存期缩短。②肥大细胞可以释放胞外体,并表达胞外体特征性蛋白CD81和TSG101,应用流式细胞术和荧光显微镜发现肥大细胞源胞外体可以被肿瘤细胞摄取,其PKH67阳性细胞数随时间增加持续增高,表明非小细胞肺癌细胞可以持续摄取肥大细胞源胞外体;Brd U细胞增殖实验表明肥大细胞源胞外体在早期即可促进细胞增殖;PI染色细胞周期实验显示肥大细胞源胞外体使肿瘤细胞S-G2/M期从27.2%升高至35.6%,G1期从73.3下降至64.3%。③在肥大细胞源胞外体促进非小细胞肺癌细胞增殖机制研究中发现,KIT通过胞外体从肥大细胞转移至肺癌细胞,是在蛋白质水平上转移,而不是转移c-kit m RNA翻译成KIT蛋白的。Western blot显示与肥大细胞源胞外体共培养的A549细胞内PI3K/Akt信号通路中磷酸化的PI3K、Akt、GSK3β蛋白表达水平与对照组相比显著增加,但是磷酸化cyclin D1蛋白表达降低,cyclin D1总蛋白升高。结论:KIT和EGFR是非小细胞肺癌负性预后因素,在肿瘤微环境中,肿瘤细胞可以摄取肥大细胞源胞外体,而且肥大细胞通过胞外体将KIT转移至肺癌细胞,并通过活化肺癌细胞内PI3K/Akt信号通路上调细胞周期蛋白表达,促进肿瘤细胞的增殖及加速肿瘤细胞周期。本研究首次阐明了肥大细胞源胞外体在蛋白质水平上转移KIT及其对肺癌细胞的作用及机制,使我们对包含KIT的肥大细胞源胞外体在非小细胞肺癌发生与发展中的作用有了崭新的认识。
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