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研究背景与目的：侵袭转移是恶性肿瘤的主要致死因素。目前已经证明肿瘤间质脉管生成与肿瘤转移密切相关。血管内皮生长因子A(VEGF-A)和血管内皮生长因子C(VEGF-C)是血管内皮生长因子家族中最重要的两种因子，其中VEGF-A在肿瘤血管和淋巴管生成过程中发挥重要作用；VEGF-C在胚胎期以及正常的成体中，对淋巴管系统的发育和维持起重要调节作用，在胚胎早期及肿瘤血管生成中与VEGF-A具有协同促进效应。因此从理论上讲，同时阻断这两种因子的表达，可更有效抑制肿瘤血管和淋巴管的新生，从而抑制肿瘤增殖和转移。
反义脱氧寡核苷酸(ASODN)是指与体内某信使核糖核酸(mRNA)或脱氧核糖核酸(DNA)具有互补序列，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而阻断其基因表达的人工合成的DNA片段，因其具有高效、低毒、特异性强、定位准确等优点，因而更具药用价值。国内外目前尚未见到利用反义脱氧寡核苷酸技术同时拮抗乳腺癌中VEGFs功能的报道。鉴于VEGF-A、VEGF-C在肿瘤间质血管、淋巴管生成中具有协同促进效应，是最重要的促进肿瘤间质脉管生成因子的特点，本研究首先用人体材料观察两种因子在乳腺癌组织中的表达情况，然后根据VEGF家族成员具有部分结构同源序列的特点，应用可同时封闭VEGF-A、VEGF-C基因表达的ASODN片段，通过体内外实验，观察该片段对乳腺癌细胞MCF-7中VEGF-A和VEGF-C基因表达的抑制作用；抑制二者表达对乳腺癌细胞增殖的影响，及对乳腺癌细胞诱导的CAM血管生成的影响，为进一步开发同时封闭VEGF-A、VEGF-C基因表达的反义药物奠定实验理论基础。
材料与方法：1.收集临床手术切除、石蜡包埋的乳腺癌标本98例、转移淋巴结42例、癌前病变7例，制成4um厚连续切片，做HE及免疫组织化学染色(SP法)，观察乳腺癌组织中VEGF-A、VEGF-C、增殖细胞核抗原(PCNA)、CD34的表达情况。结果用SPSS11.0软件包进行统计。
2.用阳离子脂质体介导寡核苷酸转染MCF-7细胞，荧光倒置显微镜观察FITC荧光标记的寡核苷酸转染率，筛选寡核苷酸的最佳浓度。
3.选最佳浓度(1uM)的反义寡核苷酸、正义寡核苷酸、错义寡核苷酸和单纯脂质体分别与MCF-7细胞共培养48h，四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)法检测MCF-7细胞生长情况。
4.选最佳浓度的寡核苷酸与MCF-7细胞共培养12、24、48、72h后，RT-PCR法检测VEGF-A和VEGF-CmRNA的表达情况。选24h为测定时间点，免疫印迹(Westernblot)法检测VEGF-A、VEGF-C蛋白表达情况。
5.活体内鸡胚尿囊膜(CAM)上观察反义脱氧寡核苷酸对血管生成的影响。
结果：
1.98例乳腺癌中癌细胞表达VEGF-A蛋白者84例(85.7％)，其中13例癌旁组织的乳腺导管上皮细胞、19例癌旁血管内皮细胞也呈阳性。VEGF-A表达在淋巴结转移组明显高于未转移组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.98例乳腺癌中，89例VEGF-C染色阳性(90.8％)，其中10例癌旁组织的乳腺导管上皮也呈阳性。VEGF-C表达水平在淋巴结转移组明显高于未转移组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.在乳腺癌细胞VEGF-A、VEGF-C阳性例中，随着两者表达增强，PCNA表达渐增强,采用RXC的等级相关α2检验，VEGF-A、VEGF-C分别与PCNA表达呈等级相关，两者均有显著的统计学意义(P＜0.001；P＜0.05)。
4.乳腺癌组织中微血管密度(MVD)与淋巴结转移关系显示，转移组MVD明显高于未转移组(P＜0.05)，且随着VEGF-A表达增强，MVD也随之增高，二者呈正相关(r=0.327，P＜0.01)，而VEGF-C表达与MVD无相关性(r=0.123,P＞0.05)。
5.阳离子脂质体介导转染MCF-7细胞：阳离子脂质体包裹有助于ASODN导入MCF-7细胞，1uMASODN转染6h后转染率可达86％。
26.ASODN对MCF-7细胞增殖的影响：1uMASODN作用MCF-7细胞48h可明显抑制MCF-7细胞增殖，MTT反应光密度(OD)值显著低于正常对照组(P＜0.01)；而正义寡核苷酸组、脂质体组和错义组与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。提示ASODN在一定程度上可抑制MCF-7细胞的增殖。
7.ASODN对MCF-7细胞VEGF-A和VEGF-C表达的影响：RT-PCR扩增条带的图像分析平均灰度值显示，1uMASODN转染MCF-7细胞12h后,VEGF-A和VEGF-CmRNA表达下调最明显，与对照组比较分别下降了55％和49％。此后，随着作用时间的延长，抑制作用逐渐减弱，VEGF-A和VEGF-CmRNA渐呈现表达，至48h后，其抑制作用基本消失。Westernblot检测，ASODN组VEGF-A和VEGF-C蛋白表达均低于对照组，而错义组和正义组与对照组比较无差异。提示ASODN可从mRNA和蛋白水平抑制VEGF-A和VEGF-C的表达。
8.ASODN对CAM新生血管的影响：脂质体组、正义组、错义组与对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05)，并且组问两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。ASODN组CAM新生血管的生成明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
结论：1.VEGF-A、VEGF-C可促进MCF-7细胞的增殖，阻断两者的表达，在一定程度上可抑制MCF-7细胞的增殖。
2.VEGF-A在乳腺癌间质血管生成中起重要促进作用。VEGF-A蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关。
3.VEGF-C蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关，但与乳腺癌间质血管生成无密切相关。
4.首次应用可同时封闭VEGF-A、VEGF-C基因表达的反义脱氧寡核苷酸片段，体外实验证明其可显著下调MCF-7细胞VEGF-A和VEGF-CmRNA的表达，进而抑制其蛋白表达，在一定程度上抑制了MCF-7细胞的增殖，有效抑制了CAM血管的增殖。提示该靶点可作为开发抑制肿瘤间质血管和淋巴管生成药物的有效作用靶点，作用于该靶点的反义药物有开发前景。