涎腺的放射损伤常使其功能低下甚至丧失,引发一系列功能障碍。对于涎腺放射损伤,传统的治疗手段治疗效果有限,不能从根本上解决问题。近年来,干细胞的研究逐渐深入,许多疾病的治疗在未来成为可能,其中骨髓干细胞和脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在涎腺放射损伤中起到一定的改善功能的效果。我们前期研究发现,ADSCs复合富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)可以在一定程度上改善放射损伤后涎腺的功能,并且较单纯的ADSCs治疗效果更好。但相关的作用机制尚不清楚,我们根据已有文献报道,推测ADSCs之所以能修复涎腺放射损伤是因为其向涎腺腺泡样细胞(salivary gland acinar-like cells,SGALCs)转分化,并且PRF起到促进转分化的作用。因此本实验研究以体外涎腺细胞(salivary gland cells,SGCs)和ADSCs共培养,并施加PRF干预,验证我们的猜想。目的探讨ADSCs向SGALCs转分化的可能性,并探究PRF在转分化中的作用,为ADSCs复合PRF治疗涎腺放射损伤提供理论依据,同时为涎腺组织工程再生提供一种更合适的种子细胞。方法1.无菌切取C3H小鼠下颌下腺,分离培养下颌下腺细胞,观察活细胞形态,HE染色细胞形态及透射电镜下腺泡细胞特有的酶原颗粒,并通过细胞角蛋白8(cytokeratin8,CK8)及波形蛋白(vimentin)免疫荧光染色,α-淀粉酶免疫荧光染色及Western Blot从蛋白水平,通过CK8、vimentin、α-淀粉酶及水通道蛋白5(aquaporin-5,AQP-5)的m RNA RT-PCR检测从基因水平鉴定细胞来源。2.无菌切取C3H小鼠腹股沟脂肪带,分离培养ADSCs,观察活细胞形态,HE染色细胞形态,MTT测定细胞生长曲线,流式检测干细胞表面分子,成脂及成骨鉴定细胞干性。3.抽取兔耳中动脉血,离心制备PRF,将获得的PRF凝胶冻干并研磨成颗粒,按25mg PRF颗粒/1ml无血清培养基的比例制备PRF浸提液,用ELISA检测其体外释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PFGF-BB)的特点,并研究其对ADSCs增殖,迁移和骨向分化的影响。4.利用孔径为0.4μm的Transwell小室放置于孔板中建立共培养系统,实验组将获得的下颌下腺细胞培养在上层小室内,ADSCs培养在下层孔板中。对照组上层小室内不含有下颌下腺细胞。在培养7天,14天和21天后,分别取对应的实验组和对照组,观察ADSCs的形态,通过α-淀粉酶,CK8及vimentin免疫荧光染色鉴定转分化情况;通过α-淀粉酶免疫荧光染色计数发生转分化的细胞,计算转分化率;最后通过α-淀粉酶Western Blot及CK8,AQP-5,vimentin和α-淀粉酶m RNA RT-PCR进一步鉴定转分化情况。5.在ADSCs成骨诱导体系中加入不同浓度的PRF浸提液(0.5%,1%,3%,5%,7%,10%),诱导7天后检测成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型胶原(collagenⅠ,COLⅠ),runt相关转录因子2(runt-related transcription factor2,RUNX2)及骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的表达,并于21天行茜素红染色。此外,以共培养系统为基础,添加不同浓度的PRF浸提液(0.5%,1%和5%),共培养7天后,正常共培养组与不同浓度PRF浸提液组分别进行α-淀粉酶免疫荧光染色,计数阳性细胞,计算脂肪来源干细胞转分化率,并进行统计学分析,以P<0.05为有统计学差异。同时对不同浓度PRF浸提液组进行α-淀粉酶Western Blot及CK8,AQP-5,vimentin和α-淀粉酶m RNA RT-PCR分析。结果1.成功培养具有良好功能的涎腺细胞:体外分离培养的小鼠下颌下腺细胞呈多边形或卵圆形,密集排列时呈铺路石样;HE染色胞浆呈红色,胞核呈蓝色,基本位于细胞中央;透射电镜观察到胞浆内存在黑色致密的颗粒,即为酶原颗粒;免疫荧光染色α-淀粉酶及CK8呈阳性,波形蛋白呈阴性;α-淀粉酶Western Blot显示约53k Da处呈现特异性条带;RT-PCR结果显示下颌下腺细胞表达CK8、α-淀粉酶及AQP-5,不表达波形蛋白。2.成功培养功能良好的脂肪来源干细胞:体外分离培养的小鼠ADSCs呈长梭形,有胞突,密集排列时呈鱼群样。HE染色胞浆呈红色,胞核成蓝色。其生长曲线大致呈“S”型,与其他干细胞生长特点相似。ADSCs阳性表达干细胞表面标志物,并具备成脂成骨分化能力。3.富血小板纤维蛋白能持续释放生长因子且一定剂量内能促进脂肪来源干细胞的增殖和迁移:由兔耳中动脉血离心制备的PRF凝胶冻干后,可研磨成颗粒状,其能持续释放VEGF和PDGF-BB。不同浓度的PRF浸提液对ADSCs的生物学行为影响不同,其中以1%PRF浸提液组对ADSCs增殖和成骨分化具有较明显的促进作用,以50%PRF浸提液组对ADSCs的迁移具有较明显促进作用。4.脂肪来源干细胞能转分化为涎腺腺泡样细胞:下颌下腺细胞诱导ADSCs发生转分化,干细胞α-淀粉酶及CK8免疫荧光染色呈现阳性,第7天,14天,21天的转分化率分别为:22.87±1.66%;40.56±1.74%;49.84±1.93%。转分化后干细胞α-淀粉酶Western Blot显示,第7天,14天,21天样本在53k Da处出现条带,其灰度值依次增高。α-淀粉酶,AQP-5及CK8 m RNA RT-PCR分析结果显示三者m RNA含量在第7天,14天,21天依次增加,Vimentin m RNA表达量依次降低。对照组干细胞未发生转分化。5.一定剂量的PRF能促进脂肪干细胞的转分化:与正常成骨诱导相比,0.5%,1%,3%和5%PRF浸提液组的ALP,COLⅠ,RUNX2及OCN表达量较高,且差异具有统计学意义,这四组中茜素红染色可见更多的矿化结节。共培养系统中,0.5%PRF浸提液组,1%PRF浸提液组和5%PRF浸提液组的干细胞7天转分化率分别为30.39±1.51%,36.20±1.33%,28.78±0.83%。与正常共培养组相比,经统计学方差分析,P<0.05,差异具有统计学意义,且不同浓度PRF浸提液组之间比较,以1%PRF浸提液组转分化率最高,与其他组具有统计学差异(P<0.05)。α-淀粉酶Western Blot及α-淀粉酶m RNA RT-PCR分析显示,PRF浸提液组与正常组具有统计学差异(P<0.05),不同浓度PRF浸提液组间比较,以1%PRF浸提液组表达量最高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.成功分离培养小鼠下颌下腺细胞,呈多边形,具有较强增殖能力,胞内含有特异性酶原颗粒,能表达特异性的α-淀粉酶,为具备良好功能的涎腺细胞。2.成功分离培养小鼠脂肪来源干细胞,长梭形,自我更新能力较强,干细胞表面标志性CD分子呈阳性,具有成脂成骨的分化潜能,为性能优良的干细胞。3.富血小板纤维蛋白富含多种生长因子,在培养液中能稳定且规律性的释放血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子-BB。富血小板纤维蛋白浸提液能促进脂肪来源干细胞的增殖和迁移,呈现一定的剂量依赖性。4.脂肪来源干细胞可以在体外转分化为涎腺腺泡样细胞,且在一定时间内,随着时间的延长,脂肪来源干细胞的转分化率逐渐增加。5.在一定剂量范围内富血小板纤维蛋白能促进脂肪来源干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞。6.脂肪来源干细胞和富血小板纤维蛋白可以在一定程度上解决涎腺组织工程再生的种子细胞问题。