研究背景卵巢储备功能低下(decreasing ovarian reserve,DOR)是指由于卵巢内储存的可募集的卵泡数目减少或卵母细胞质量下降,从而导致月经稀发以及经量减少、卵巢早衰或过早绝经,最终导致生育能力下降甚至不孕的现象。影响DOR发生的原因及机制有很多,包括基因、年龄、激素水平波动等。国内外学者的研究结果普遍呈现出随着女性年龄的增长,其卵巢的储备功能也受到了一定的影响呈现功能逐渐减弱的趋势的特点。DOR为无排卵性不孕的常见原因之一,在对此不孕症患者行控制性超促排卵(Controlled ovarian hyperstimulation,COH)时,呈现出卵巢反应低下、卵子品质降低、获卵数减少、受精率不高、优质胚胎数量减少及妊娠率下降等现象。对不孕症妇女采取COH进行卵巢刺激的研究中,卵巢低反应发生率约9%-24%。此外,由于卵巢反应低下导致5%-18%的IVF周期取消率。随着对DOR患者研究越来越深入,对其治疗取得了较大进展,包括促排卵方案的改变、预治疗的药物的应用等。其中对预治疗药物的应用研究多样,例如脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)、生长激素、辅酶Q10、中药验方等等。DHEA是近年来应用于治疗DOR患者较为广泛的雄激素,其作用机制以及应用都受到了世界范围内的密切关注。研究显示,对DOR患者采用低剂量的雄激素,对于患者卵泡储备的募集并进入其生长发育区域有促进作用,并且在雄激素的作用下,窦前卵泡及窦卵泡上的雄激素受体发挥促进作用,使得卵泡膜间质细胞及颗粒细胞的增生,从而减少卵泡的凋亡和闭锁等,这些机制的改变能够改善卵巢的反应性。近年来,对DHEA的研究不断深入,DHEA的生理及病理活性得到进一步阐明,如调节糖尿病,抗癌、增强免疫力和延缓衰老等生理及病理活性被越来越多的研究证实。同样地,DHEA在辅助生殖方面的研究也随着研究技术的发展不断深入。对DHEA治疗的有效性尚存争议。此外DHEA对卵巢的作用机制,其对卵泡募集的影响原理还不明确。本研究主要分两部分,首先从临床观察DHEA对行IVF-ET的DOR不孕患者治疗结局的影响,接着在建立动物模型的基础上研究DHEA预处理对DOR小鼠模型性激素及卵巢组织的改变,从而探讨DHEA对卵巢的作用机理。第一部分 脱氢表雄酮对行IVF-ET的卵巢储备功能低下不孕患者治疗结局的临床研究目的:本研究分别通过对卵巢储备功能低下的不孕症患者进行DHEA预处理,分析基础卵巢激素以及胚胎质量从而探讨DHEA对卵巢储备功能的作用影响。方法:回顾性分析2015年1月至2015年9月在中山市博爱医院生殖中心接受治疗的卵巢储备功能下降患者169例,根据周期超促排卵前(COH)是否接受辅助治疗,将患者分为DHEA治疗组(n=89)和对照组(n=80),DHEA治疗组均有1次IVF-ET失败经历。DHEA治疗前、后IVF周期相关指标行自身对照比较,并分别与同期对照组比较。研究组患者再次接受体外受精/卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI)治疗治疗前口服DHEA25mg每三次辅助治疗,疗程为3个月;对照组患者IVF/ICSI-ET周期前未使用辅助治疗。比较两组患者的一般情况(年龄、不孕年限、基础激素水平、窦卵泡计数等)、超促排卵情况(总量、使用天数、hCG日E2水平、获卵数、胚胎发育(受精数、卵裂数、优质胚胎数、受精率、卵裂率、优质胚胎率等)及临床治疗结局(胚胎种植率、临床妊娠率、流产率及周期取消率)。结果:两组年龄、不育年限、BMI和不孕原因比较,差异均无统计学意义。DHEA治疗组治疗前、后BMI、基础LH、基础E2、基础T比较,差异均无统计学意义;DHEA治疗组治疗前、后AFC、AMH比较,DHEA治疗组治疗后基础FSH、AMH与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。DHEA治疗组治疗前、后和对照组Gn总剂量、Gn使用天数、hCG日E2之间比较,差异均无统计学意义;DHEA治疗组治疗后获卵数较治疗前升高,差异有统计学意义;DHEA治疗组治疗前、后优质胚胎数比较,以及分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。DHEA治疗组治疗前、后和对照组受精率、周期取消率之间比较,差异均无统计学意义;DHEA治疗组治疗后卵裂率、临床妊娠率较治疗前组及对照组升高,差异有统计学意义;DHEA治疗组治疗后流产率、多胎妊娠率、活产率与对照组比较,差异均无统计学意义(P<0.05)。结论:DHEA可以改善重复周期的DOR患者卵巢反应性,提高优质胚胎的数量,改善妊娠结局。第二部分DOR模型小鼠的建立及评价目的:为了进一步研究DHEA对卵巢的影响,本章主要实验目的为构建DOR模型小鼠。方法:建模组先分别给10只小鼠腹腔注射5IU孕马血清;注射54h后,对小鼠行腹腔注射5IU绒毛膜促性腺激素;注射19h后,再行腹腔注射25IU前列腺F2α。3次注射为1个完整的超排周期,12h后开始下一个周期,共进行10个周期。同时,试验期间每晚21:00至次日上午9:00将建模组的小鼠放入臭氧接触箱中,保持臭氧接触箱中心臭氧浓度不变,稳定在2.8 mg/m3左右。对照组为10只小鼠先腹腔注射生理盐水(与5IUPMSG等体积),54h后给予生理盐水(与5 IUHCG等体积)腹腔注射,19h后再行生理盐水(与25IUPGF2α等体积)腹腔注射。1个完整的超排周期要行使3次腹腔注射才算完成,12 h后则开始进行下一个超排周期,总共进行10个周期,常规饲养,每日清晨定时记录雌鼠动情周期的变化情况。结果:与对照组比较,建模组的每低倍镜视野卵泡计数较对照组降低,且始基卵泡比例减少至18.99%,而对照组的始基卵泡占27.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组血清FSH、LH较建模组显著升高(1.27±0.37vs41.46±1.53IU/L,289.13± 23.64vs728.36 ± 25.90ng/L),差异有统计学意义。对照组血清 E2、AMH、INHB 较建模组显著降低(16.45±0.57vs13.45±0.39ng/L,12.02±2.53vs2.8±1.13ng/L,23.45±1.12vs10.18±0.57 ng/L),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:造模后的小鼠出现卵巢储备下降即确定成功建立DOR模型。第三部分脱氢表雄酮对DOR模型小鼠激素及卵巢影响的研究目的:探讨脱氢表雄酮对卵巢储备功能低下(DOR)小鼠激素及卵巢的影响。方法:连续序贯腹腔注射孕马血清(PMSG),人绒毛膜促性腺激素(HCG),前列腺素F2α(PGF2α)产生连续超数排卵,再结合臭氧吸入构建DOR模型。将小鼠随机分为正常组、DOR模型组、和脱氢表雄酮(DHEA)治疗组,每组10只。DHEA组给予0.4mg/0.3ml DHEA灌胃,而正常组与模型组均给予相同剂量生理盐水灌胃21天。采用ELISA法检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)和抗苗勒氏管激素(AMH)等水平以及通过Real time-PCR检测FSH受体mRNA的变化,同时通过HE染色结合显微镜观察卵巢内各级卵泡数目及占比。结果:与模型组比较,DHEA治疗组血清E2、P及AMH水平均明显升高,且卵巢平均每低倍视野卵泡数量增加;同时DHEA给药能够降低由于DOR过程导致的FSH受体表达量上调。结论:DHEA能改善雌性DOR小鼠激素与相应受体表达,增加窦卵泡比例,但不能增加始基卵泡数目而改善卵巢功能。