论文部分内容阅读
Derlin-1是2001年利用消减抑制杂交技术克隆的一个新基因。该基因定位于内质网膜上，参与错误折叠蛋白从内质网腔到细胞质的转运。2003年，首次发现Derlin-1在人肝海绵血管瘤内皮细胞中的表达与其它多种血管内皮细胞相比显著下调，同时，首次观察到人肝海绵血管瘤内皮细胞中的内质网异常膨胀。到目前为止，Derlin-1与内质网结构异常之间的关系未见报道。因此，本文以人肝海绵血管瘤内皮细胞为模型，对Deflin-1在内质网上表达的作用及其功能展开了研究。此外，通过生物信息学分析发现，除了内质网以外，Derlin-1也可能定位于质膜上。到目前为止，Derlin-1在质膜上的定位及功能也未见报道。因此，文中也对Derlin-1新的亚细胞定位及其可能具有的新的功能也展开了研究。
一、Derlin-1在内质网上表达的功能及机理研究。采用RT-PCR、Western blot、组织免疫荧光等方法，从体内外水平检测Derlin-1在多种人血管内皮细胞中的表达，结果显示Derlin-1在人肝海绵血管瘤内皮细胞中的表达水平显著低于其它血管内皮细胞。采用透射电镜技术，从体内外水平观察多种人血管内皮细胞中内质网的超微结构，发现Derlin-1表达下调的人肝海绵血管瘤内皮细胞中内质网异常膨胀，而其它血管内皮细胞中的内质网结构正常。将含Derlin-1基因的重组质粒转染人肝海绵血管瘤内皮细胞，发现50个细胞中有26个细胞的内质网恢复正常，而空载体转染的细胞中内质网仍异常膨胀。根据这些实验结果推断，人肝海绵血管瘤内皮细胞内质网的异常膨胀可能与Derlin-1的表达下调有关。
采用RT-PCR、组织免疫荧光等方法，从体内外水平检测未折叠蛋白应急反应(unfolded protein response，UPR)活化的标记基因Bip或XBP1在多种人血管内皮细胞中的表达或剪接情况。结果显示：Derlin-1表达下调的人肝海绵血管瘤内皮细胞中，Bip表达显著上调，XBP1发生了UPR特异的剪接，表明UPR得到活化。将含Derlin-1基因的重组质粒转染人肝海绵血管瘤内皮细胞，RT-PCR结果显示，Bip的表达水平下调，XBP1的剪接程度下降，表明UPR的活化程度降低。根据这些实验结果，推断UPR可能是内质网异常膨胀和Derlin-1表达下调相关的分子机制之一。
二、Dorlin-1在肿瘤细胞质膜上的表达及其功能的初步研究。采用RNAi技术敲降Derlin-1在人宫颈癌细胞：HeLa中的表达，结果显示，RNAi介导的Derlin-1表达下调对HeLa细胞的增殖、凋亡和细胞周期均无明显影响，表明Derlin-1对于HeLa细胞的功能并不是必不可少的。
采用多款生物软件预测Derlin-1的亚细胞定位，发现内质网驻留蛋白Derlin-1也可能定位于质膜上。在该部分研究中，活细胞免疫荧光实验结果显示，Derlin-1表达于多种肿瘤细胞的质膜上，而且呈极性表达，即只表达于细胞膜的基质面上。竞争抑制实验证明，Derlin-1抗体对肿瘤细胞质膜的染色是特异的。Derlin-1与CEA的共定位研究进一步证明，Derlin-1表达于肿瘤细胞质膜上。利用胰酶消化后的肿瘤细胞进行活细胞免疫荧光实验，结果表明质膜上的Derlin-1蛋白的C端面向胞外。
采用活细胞免疫荧光、冰冻切片免疫荧光等方法，从体内水平检测Derlin-1的亚细胞定位，结果显示，Derlin-1表达于活体来源的或切片上的结肠癌细胞的质膜上。用<125>I标记的Derlin-1抗体进行体内分布及显像研究，结果显示，Derlin-1在肿瘤组织特异聚集，表明Derlin-1特异表达于结肠癌细胞的质膜上。
在体外利用Derlin-1抗体封闭结肠癌细胞质膜上的Derlin-1，结果显示，Derlin-1抗体对结肠癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期无明显影响，但对结肠癌细胞与细胞外基质Collagen I之间的粘附有抑制作用，提示Derlin-1可能在肿瘤细胞的粘附中发挥作用。利用Derlin-1抗体进行体内抑瘤实验，结果显示，不同剂量的Derlin-1抗体均能够显著抑制结肠癌移植瘤的生长，高剂量和低剂量的抑瘤率分别为54.84％和53.23％。免疫组化结果显示，与对照组相比，Derlin-1抗体治疗组中PCNA和Ki67阳性细胞的比例显著降低，p27的表达上调，表明Derlin-1抗体能够抑制结肠癌细胞的增殖，而p27表达上调是其中机制之一。此外，与对照组相比，Derlin-1抗体治疗组中的β-catenin表达下调，表明Derlin-1抗体能够抑制结肠癌细胞的粘附。免疫组化的结果提示，Derlin-1抗体可能通过抑制细胞的增殖、粘附来抑制结肠癌移植瘤的生长。免疫组化检测UPR活化的标记基因Bip的表达，结果显示，Bip在Derlin-1抗体治疗组和对照组中的表达无明显差别，这提示Derlin-1抗体的抑瘤作用可能与内质网上表达的Derlin-1无关。