草酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.3)催化草酰乙酸脱羧形成丙酮酸和二氧化碳。这个蛋白家族大体上分为两类,一类是膜蛋白复合体Na+泵亚家族,另外一类是存在于胞质的可溶性草酰乙酸脱羧酶亚家族。Cgl458是来源于谷氨酸棒杆菌中的可溶性草酰乙酸脱羧酶,序列比对结果显示它属于富马酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetate hydrolase, FAH)家族蛋白。FAH是催化酪氨酸和苯丙氨酸代谢途径最后一步反应的代谢酶类,它水解富马酰乙酰乙酸产生的乙酰乙酸和富马酸会继续参与到柠檬酸循环中。FAH家族已有很多成员的结构被解析,但是没有一个成员被报道具有草酰乙酸脱羧酶活性。对Cg1458结构的研究有助于了解其脱羧的作用机理。膜蛋白复合体草酰乙酸脱羧酶属于Na+离子转运脱羧酶家族,它们将草酰乙酸脱羧产生的能量将Na+离子泵出胞外,由此产生的Na+离子梯度可用于进行溶质的吸收,鞭毛的运动或是通过F型ATP合酶来合成ATP。虽然来源于霍乱孤菌草酰乙酸脱羧酶的α亚基的羧基转移活性结构域的三维结构已经被解析,但这个结构的解析尚不能够对羧基的转移及脱羧的具体机理作出明确的回答,同时也由于没有相应的p亚基的三维结构,因此具体的脱羧机制及钠离子的转运机制都不清楚。对复合体蛋白的表达纯化条件的摸索,有助于获得稳定并且状态均一的复合体蛋白,为后续获得高质量的草酰乙酸复合体晶体奠定基础。为了研究可溶性的草酰乙酸脱羧酶的特性及其催化机制,我们克隆表达并纯化得到了Cg1458草酰乙酸脱羧酶。通过对其生化特性的鉴定,我们发现Cg1458的最适反应pH值为Tris-HCl pH8.0,其活性可被一些二价金属离子如Mg2+,Mn2+,Ca2+,Co2+,Ni2+,Cu2+等激活,当用EDTA螯合掉蛋白中的金属离子时,Cg1458则完全丧失了活性,当加入某些二价金属离子如Mg2+,Mn2+,Ca2+及Co2+则可回补Cg1458的活力。我们发现草酸是Cg1458的一种抑制剂,5mM草酸即可完全抑制Cg1458的活力。运用气相扩散方法我们还获得了Cg1458野生型蛋白的晶体及其与草酸共结晶的复合体的晶体,并分别收集到1.9A和2.0A的衍射数据,运用FAH家族蛋白的晶体结构(PDB ID2DFU)作为模板,通过分子置换的方法分别解析了Cg1458的野生型及复合体的晶体结构。在草酸复合体晶体中存在一段在野生型晶体中缺失的loop区,这段loop区可以作为盖子,在底物进入活性中心时阻断底物通道,在完成反应循环后打开使产物释放。通过对Cg1458结构进行分析,我们找到了一些可能的催化位点,并对其进行了定点突变,分别纯化了突变体蛋白并测定其草酰乙酸脱羧酶活力,结果显示除Cg1458E76A突变体还剩余35%酶活力外,其余突变体均丧失酶活力。根据Cg1458及突变体的生化特性及两种构象的结构,并结合分子模拟实验,我们提出Cg1458中的盖子结构域是一种具有催化活性的盖子结构域,Cg1458的催化机制为一种Glu-His-water三联体的催化机制。通过对FAH家族蛋白已经解析的晶体结构的比较及大规模的同源序列比对,我们发现这种三联体的催化机制是一种在FAH家族蛋白中催化C-C键水解的通用机制。为了解析草酰乙酸脱羧酶复合体的三维晶体结构,首先必须获得大量状态均一的草酰乙酸脱羧酶复合体,前期的研究均显示草酰乙酸脱羧酶复合体不是很稳定。因此我们尝试着表达来源于海洋细菌Staphylothermus marinus F1菌株的草酰乙酸脱羧酶复合体,并对来源于霍乱孤菌的草酰乙酸脱羧酶进行了一系列的改造,包括将p亚基单独表达或与其它亚基进行融合表达,以及在p亚基的不同位置引入his-tag等,以期获得状态均一的草酰乙酸脱羧酶复合体。结果表明,来源于海洋细菌S. marinus F1的草酰乙酸脱羧酶复合体在受试条件下没有获得异源表达产物。对来源于霍乱弧菌的草酰乙酸脱羧酶复合体的改造试验,我们不能获得单独以及亚基融合表达的表达产物。在p亚基上添加his-tag的表达试验中,我们发现在110位引入his-tag导致复合体完全不能表达；而在256位及300位引入his-tag,草酰乙酸脱羧酶复合体都能表达,但只有256位引入his-tag的复合体蛋白具有草酰乙酸脱羧酶活性。因此我们还筛选了纯化该蛋白时选用的去污剂,并分别用不同的去污剂对其进行了纯化。发现在以麦芽糖苷类非极性去污剂纯化复合体的时候,能够较好地提纯到β亚基,这些工作为获得大量状态均一的复合体蛋白奠定了基础。蛋白水解酶是催化蛋白质水解的一类酶,是酶学中较早也较深入研究的一类酶。TTHA1296蛋白水解酶是极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中基因编码的一种以Ser/Lys二联体为活性中心的丝氨酸蛋白水解酶。为了明确TTHA1296的特性及催化机理,在前期我们找到了能被TTHA1296特异性切割的底物蛋白Oad525的基础上。我们运用这个底物对TTHA1296的生化特性进行了鉴定,并对其突变体蛋白TTHA1296S295A进行了结晶条件的筛选。为了确定TTHA1296切割底物的位置,我们选择了Oad525及同样表达方式表达的更短的Oad454作为底物,结果显示TTHA1296(?)(?)切割Oad525而不能切割Oad454,因此我们判定,TTHA1296切割底物的C末端。通过对其生化特性进行研究,我们发现其最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0,并且有很好的热稳定性,在85℃处理下仍有大部分酶蛋白以可溶性蛋白形式存在,且还保留有蛋白水解酶活性。TTHA1296的酶活性不受常规蛋白酶抑制剂和金属离子的影响。对TTHA1296的突变体蛋白TTHA1296S295A的结晶条件筛选,我们得到了可以衍射到3.0A的野生型晶体,将其与底物Oad525进行共结晶后,得到了其与小肽复合体晶体,可以衍射到2.45A。但是由于TTHA1296与其它已有结构的同源蛋白的同源性较低,因此利用已经收集的数据运用分子置换方法未能够解析其三维结构,因此需要采用试验方法如SAD或MAD解析其三维晶体结构。