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肿瘤组织细胞是非均质的,就肿瘤干细胞而言,其特异生物学功能在肿瘤异质性形成过程中起着极为重要的作用,并决定着肿瘤的发生进展。SALL4是近两年新发现的一个肝癌干细胞的分子标志物,被认为是潜在的肝癌治疗靶点。本论文的前期研究中,利用质谱技术分析了 SALL4免疫沉淀物中的蛋白组分,筛选到一系列SALL4的潜在结合蛋白,包括Ku80。本论文首先用免疫共沉淀实验证实了这两个蛋白的相互作用。那么Ku80结合SALL4是否参与调控肝癌细胞的干性?是否由此导致肝癌细胞的功能异质性?Ku80调控肝癌细胞干性的功能所依靠的机制原理是什么?我们通过后续研究,验证了 SALL4和Ku80的结合作用及其具体结合区域,分析了 Ku80对肝癌细胞干性及干性相关的迁移、侵袭的表型的影响,并进一步探讨了 Ku80-SALL4的结合在Ku80抑制肝癌干性中的作用机制。结果发现,①免疫共沉淀实验证实了 Ku80与SALL4二者的相互作用。进一步的结合区域分析结果显示,Ku80的C端氨基酸449-732结构域和SALL4的N端氨基酸300-500区域的C2H2基序,是两者结合的关键结构域。②在肝癌细胞中过表达Ku80,观察Ku80对肝癌细胞成球、侵袭、迁移等恶性表型的影响,实验表明Ku80可以明显阻抑肝癌细胞的成球、侵袭以及迁移。进一步用qPCR和免疫印迹实验检测Ku80对SALL4和其它干性相关基因表达的影响,结果表明Ku80并不影响这些基因的mRNA表达,也不影响SALL4的蛋白表达,然而干性因子OCT4的蛋白表达量则降低的十分明显。进一步的研究显示,溶酶体抑制剂NH4Cl处理逆转了 Ku80对OCT4蛋白表达的下调作用,即Ku80抑制肝癌细胞干性的功能,可能是通过诱导OCT4的溶酶体降解这一途径。③Ku80对肝癌细胞干性的抑制功能,依赖于其与SALL4的相互结合。过表达Ku80的缺失突变体,检测其对OCT4蛋白表达的影响,结果显示只有能够结合SALL4的Ku80突变体,才能发挥抑制OCT4蛋白表达的功能。Co-IP实验结果揭示,Ku80竞争性结合SALL4,导致SALL4-OCT4结合分开,进而OCT4出核降解。通过免疫荧光标记及激光扫描共聚焦显微镜的细观分析发现,过表达Ku80会诱导OCT4从细胞核重新定位至胞浆。综上,本研究论文首次发现并验证了 SALL4和Ku80的相互作用,确定了两者结合的具体结构域,并证实Ku80通过竞争性结合SALL4,导致SALL4-OCT4分开,OCT4出核降解,从而抑制了肝癌细胞的干性。