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目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）常引起脑干、胼胝体等皮质下白质中的弥漫性轴索损伤（Diffuse axonal injury,DAI）,由于神经连接中断,常导致昏迷及认知、自主运动和感觉功能等神经功能缺损症状,给家庭和社会带来了沉重的经济负担。故寻找安全便捷有效的改善神经功能缺损疗法,降低重残率,使患者尽快回归家庭和社会具有重要意义。手十二井穴刺络放血疗法（（简称井穴放血法））是独具中医特色的急救疗法之一,简便安全。研究团队的前期结果已证实井穴放血法可有效改善多种中枢神经损伤（Central nervous system injury,CNSI）患者及动物模型的神经功能缺损症状,但其实现神经保护的作用机制尚未完全阐明,限制了针灸技术的临床应用和推广。本研究在明确井穴放血法可改善TBI大鼠神经功能缺损效应基础上,从炎症调节和促进神经元再生两个角度揭示该法神经保护的潜在作用机制,为该法的临床应用和推广提供依据。方法:实验一手十二井穴刺络放血改善TBI大鼠神经功能缺损的效应研究将24只健康成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（TBI组）、TBI+手十二井穴放血组（Acupuncture at Jing-Well points,JW Acu组）、TBI+十宣放血组（Acupuncture at Ten-Xuan points,TX Acu组）。采用电子控制性脑皮质撞击仪（electronic controlled cortical impactor,e CCI）制备实验性重型TBI模型,Sham组仅开骨窗不撞击,井穴放血组和十宣放血组在大鼠的手十二井穴和十宣处施以放血干预。采用改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,m NSS）和六级意识分级法评价井穴放血法改善神经功能缺损效应和其效应的穴位特异性。实验二手十二井穴刺络放血改善TBI大鼠神经功能缺损症状的作用通路筛查研究将15只健康成年SD大鼠分为Sham组、TBI组和JW Acu组,提取各组大鼠脑干总RNA进行基因芯片（Gene chip technology,GCT）检测,将基因表达差异倍数（Foldchange）≤0.5或≥2的基因判定为差异基因,应用KEGG、GO和蛋白网络互作（ProteinProtein Interaction Network,PPI）分析GCT所得到的聚集系数排前30的关键通路和基因。实验三手十二井穴刺络放血调节TBI大鼠脑干炎症及其信号通路的分子机制研究将42只健康成年SD大鼠分为Sham组、TBI组和JW Acu组,利用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）技术,对筛选出来的炎症通路的差异基因和M1/M2小胶质细胞相关标志物基因进行检测,包括Il1b、Tnf、Il12a、Il20rb、Il1rl1、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl10、Cxcl11、Cxcl3、Cxcl13、Ccl7、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl6、Nos2、Cd86、Tgfb、Arg1。采用液相芯片技术检测IL-1β、TNF-α、CXCL2、IL-6、IL-2、IL-10、IL-13的蛋白含量。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测小胶质细胞活化相关的JNK、p38 MAPK、NF-κB p65和IκB总蛋白和磷酸化蛋白水平。实验四手十二井穴刺络放血调节TBI大鼠脑干细胞增殖功能初探将42只健康成年SD大鼠分为Sham组、TBI组和JW Acu组,利用RT-q PCR技术对筛选出来的细胞周期通路相关差异基因Bdnf、Bub1、Mad2l1、Mcm3、Ccna2、Ccnb2进行验证。结果:1.手十二井穴刺络放血可改善TBI大鼠的神经功能缺损症状本实验结果如下:（1）与Sham组相比,TBI后4 h大鼠意识状态下降（*P<0.05）;与TBI组相比,JW Acu组/TX Acu组大鼠意识状态好转（▲P<0.05）。本实验表明井穴放血法/十宣放血法具有改善TBI大鼠意识状态的作用。（2）与Sham组相比,TBI后6 h、24h、48 h的m NSS评分显著增高,有统计学差异（**P<0.01）,说明TBI致神经功能缺损模型制备成功。TBI后6 h和48 h,与TBI组相比,JW Acu组的m NSS评分降低,有统计学差异（▲P<0.05）;TX Acu组有降低趋势,未见统计学差异。TBI后24 h,与TBI组相比,JW Acu组/TX Acu组m NSS评分有降低趋势,未见统计学差异。综合以上实验结果,说明井穴放血法在改善神经功能缺损方面优于十宣放血法,存在穴位特异性,故后续实验均采用井穴放血法探讨改善TBI大鼠神经功能缺损的分子机制。2.手十二井穴刺络放血改善TBI大鼠神经功能缺损作用可能与炎症调节和细胞增殖信号通路有关TBI组与Sham组比较GO富集的通路很多与炎症相关,如趋化因子活性、CXCR3趋化因子受体结合、趋化因子受体结合、CCR2趋化因子受体结合、CCR1趋化因子受体结合等;KEGG分析结果为趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路,提示脑干炎症反应可能参与TBI急性期病理过程。JW Acu组与TBI组比较GO富集到与炎症相关的趋化因子受体结合、CXCR3趋化因子受体结合、CCR2趋化因子受体结合等通路;KEGG通路分析结果则为趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和细胞周期等通路。PPI分析结果提示,这些通路中相关基因的节点数较高且彼此联系紧密。以上结果提示井穴放血法可调控脑干炎症反应和细胞增殖信号通路。3.手十二井穴刺络放血可抑制TBI大鼠脑干炎症反应及调节相关信号通路（1）井穴放血可抑制脑干炎症反应中的部分促炎因子和趋化因子基因表达TBI后6 h,与Sham组比较,TBI组Cxcl2、Cxcl10、Cxcl11、Cxcl13、Ccl2基因含量上升,有统计学差异（*P<0.05,**P<0.01）;部分因子基因含量有升高趋势,未见统计学差异:Il1b（68.15%）、Tnf（121.02%）、Cxcl3（139.61%）、Ccl7（143.21%）、Ccl3（138.16%）、Ccl4（138.25%）;Ccl6下降25.3%,未见统计学差异;其它因子无明显变化。与TBI组比较,JW Acu组Il1b、Il12a、Il20rb、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl10、Cxcl11、Cxcl13、Ccl2基因含量下降,有统计学差异（▲P<0.05,▲▲P<0.01）;部分因子有下降趋势,未见统计学差异:Cxcl3（69.25%）、Ccl7（32.29%）、Ccl3（62.81%）、Ccl4（52.59%）、Tnf（58.31%）;其它因子无明显变化。TBI后48 h,与Sham组比较,TBI组Il1b、Tnf、Nos2、Cxcl2基因含量上升且有统计学差异（*P<0.05）;部分因子有升高趋势,未见统计学差异:Cxcl10（58.51%）、Cd86（54.22%）、Ccl2（574.28%）、Ccl7（776.16%）、Tgfb（48.57%）;Arg1基本无变化。与TBI组比较,JW Acu组Il1b、Nos2、Cd86、Cxcl10、Cxcl2、Tgfb基因含量下降,有统计学差异（▲P<0.05）;部分因子有降低趋势,未见统计学差异:TNF（26.11%）、Ccl2（54.15%）、Ccl7（41.97%）;Arg1无明显变化。（2）井穴放血可抑制脑干炎症反应中的部分促炎因子和趋化因子蛋白表达TBI后6 h,与Sham组比较,TBI组IL-1β、CXCL2、IL-6蛋白含量上升,IL-2蛋白水平下降,均有明显统计学差异（**P<0.01）;TNF-α、IL-10、IL-13变化不明显。与TBI组比较,JW Acu组CXCL2下降,有统计学差异（▲P<0.05）;其它因子变化不明显。TBI后48 h,与Sham组比较,TBI组IL-1β蛋白含量升高,有明显统计学差异（**P<0.01）;其它因子无明显变化。与TBI组比较,JW Acu组TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白含量下降,有统计学差异（▲P<0.05,▲▲P<0.01）;其它因子无明显变化。（3）井穴放血可通过抑制TBI大鼠脑干JNK/p38 MAPK通路改善脑干炎症TBI后6 h,与Sham组相比,TBI组大鼠脑干中JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、IκB-α磷酸化水平基本无变化。与TBI相比,JW Acu组以上蛋白磷酸化水平均无明显变化。TBI后48 h,与Sham组相比,TBI组大鼠脑干中JNK磷酸化水平升高,有统计学差异（*P<0.05）;NF-κB p65磷酸化水平升高36%,未见统计学差异;p38 MAPK、IκB-α磷酸化水平无变化。与TBI相比,JW Acu组大鼠脑干中JNK、p38 MAPK磷酸化水平降低,有统计学差异（▲P<0.05）;NF-κB p65、IκB-α磷酸化水平无差异。4.手十二井穴刺络放血可促进TBI大鼠脑干细胞增殖相关因子基因表达TBI后6 h,与Sham组比较,TBI组Bdnf、Mcm3基因含量下降,有统计学差异（*P<0.05）;Ccna2、Ccnb2分别下降了32.56%和45.21%,未见统计学差异;Mad2l1、Bub1基本无变化。与TBI组比较,JW Acu组中Bub1基因含量降低,有统计学差异（▲P<0.05）;Ccna2下降了25.77%,未见统计学差异;其它因子无明显变化。TBI后48 h,与Sham组比较,TBI组Bdnf（75%）、Bub1（37.04%）有下降趋势,Ccna2升高55.56%,均未见统计学差异;Ccnb2、Mad2l1无明显变化。与TBI组比较,JW Acu组Bdnf、Ccna2升高,有统计学差异（▲P<0.05）;其它基因有升高趋势,未见统计学差异:Ccnb2（45.45%）、Bub1（52.94%）、Mad2l1（87.5%）。结论:1.手十二井穴刺络放血可改善TBI大鼠神经功能缺损症状,且具有穴位特异性。2.手十二井穴刺络放血可抑制TBI大鼠脑干炎症反应,表现为抑制JNK/p38 MAPK通路,减少促炎因子/趋化因子产生,推测改善炎症可能是井穴放血法改善神经功能缺损症状的作用通路之一。