水稻条纹叶枯病是水稻的主要病害之一,给水稻生产造成了严重损失。该病的病原为水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV),主要由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus)以循回增殖的方式传播,一旦染毒可持久性传毒,并可经卵传播给下一代幼虫,因此给防治工作带来了困难。RSV是是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表种,基因组由4条单链RNA组成,共编码7种蛋白质。其中Pc2蛋白由RSV RNA2的反义链编码,分子量为94kD。由于Pc2蛋白分子量比较大,翻译后经历复杂的修饰过程,并且可能具有细胞毒性,造成了它研究的困难。相对于RSV编码的其它蛋白,Pc2相关的研究工作开展的很少,目前仅有其序列测定结果及体内检测的报道。Pc2-N可以在病株和灰飞虱中检测到,暗示Pc2蛋白可能在介导病毒传播及诱导宿主植物症状的发生中均起作用,是一个重要的、多功能蛋白。本文对Pc2蛋白在细胞中的定位、加工、功能及与宿主的相互作用展开系统研究,从而为深入研究该蛋白在病毒侵染、致病及传播过程中所起的作用奠定基础,为控制病害的发生提供一定的理论依据。本论文第一章以综述的形式论述了RSV的研究概况,包括其危害、分类、基因组结构及编码蛋白的功能。另外简单介绍了植物病毒膜蛋白的功能和本文中所用的酵母双杂交技术。第二章研究了RSV Pc2蛋白在昆虫细胞中的亚细胞定位及加工分析。软件预测Pc2蛋白的氨基酸序列中存在4个跨膜区(TM1、TM2、TM3和TM4)和两个信号肽酶切割位点(scl和sc2)。从感染RSV的水稻病叶中提取总RNA,并以此为模板经RT-PCR扩增了pc2基因的全长。其N端和C端分别融合增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因,转染昆虫细胞Sf9。用抗GFP的单克隆抗体检测融合蛋白的表达,结果显示部分Pc2蛋白在Sf9细胞中被切割成两部分,Pc2-N和Pc2-C。进一步分析表明在预测的第一个切割位点处(18与19个氨基酸之间)未发生切割,而在第2个切割位点处(381与382氨基酸之间)发生了部分切割。共聚焦显微镜观察结果显示,eGFP-Pc2和Pc2-eGFP融合蛋白均与内质网荧光探针共定位于内质网,而作为对照的eGFP则分布于整个细胞中。另外,单独表达的Pc2-N(?)pC2-C均能转运到内质网中,这说明Pc2-N和Pc2-C中均含有内质网定位信号。构建一系列Pc2突变体进一步研究Pc2蛋白的跨膜区,激光共聚焦显微镜与亚细胞分层结果显示,Pc2蛋白中存在3个跨膜区,为TM2、TM3和TM4,它们均能独自将其融合的eGFP携带到内质网中,而TM1则不能定位于内质网。综合以上的结果,我们提出了一个Pc2蛋白的结构模型：Pc2蛋白中存在一个信号肽(TM3),其后紧随信号肽酶加工位点(381与382位氨基酸残基之间),另外N端和C端分别有一内质网定位区。Pc2可能首先翻译为一蛋白前体,随后被加工成两个成熟蛋白Pc2-N和Pc2-C。Pc2-N(?)Pc2-C均能单独表达且被转运到内质网中。第三章分析了Pc2蛋白的膜融合活性。序列分析显示,RSV Pc2与布尼亚病毒科一些病毒的膜蛋白有相似性,包含保守的融合肽序列和C端的跨膜区,暗示它可能象这些病毒的膜蛋白一样具有诱导膜融合的功能。为了更便捷研究Pc2的膜融合活性,利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统构建了昆虫细胞表面展示系统。在供体质粒的多角体启动子下依次插入杆状病毒AcMNPV的GP64信号肽序列,目的基因,水疱口膜炎病毒(VSV)的跨膜区及C端细胞质区。然后供体质粒以Tn7介导的转座方式插入AcMNPV中来构建重组病毒。共聚焦显微镜观察显示,构建的杆状病毒膜表面表达系统使本不在细胞膜表面的eGFP蛋白展示在昆虫细胞的膜表面。免疫荧光也表明,利用该系统病毒的衣壳蛋白(CP)、Pc2以及其缺失突变体均成功在昆虫细胞内表达并被转运到细胞膜表面。低pH诱导并观察感染有重组病毒的细胞是否有合胞体的形成,结果表明,低pH条件下Pc2没有诱导膜融合。另外,当Pc2与病毒的衣壳蛋白(CP)在昆虫细胞内共表达时,也没有观察到膜融合产生。因此,Pc2可能与其同源的膜蛋白不同,可能具有不同的功能。第四章构建了水稻的酵母双杂交cDNA文库,并以Pc2为诱饵从水稻cDNA文库中筛选到了与之互作的蛋白。提取水稻总RNA,分离mRNA,利用同源重组技术构建了水稻的酵母双杂交cDNA文库。经过检测表明：构建的水稻cDNA文库滴度为4x107CFU/mL,且大多数插入片段在500-2000bp之间,质量符合筛选要求。分别将编码Pc2N端(Pc2-N)与Pc2C端(Pc2-C)的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,成功构建了诱饵载体pGBK-Pc2-N与pGBK-Pc2-C。诱饵蛋白的毒性与自激活检测结果显示,Pc2-N对酵母菌株AH109没有毒性,也没有白激活的能力。但是Pc2-C对酵母具有细胞毒性,因此不能用于后续的酵母双杂交筛选。随后利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库寻找与其互作的寄主因子。经过筛选和共转化回转验证,有8个候选阳性克隆与Pc2-N在酵母中互作。测序得到这些克隆的cDNA序列,BLAST分析结果表明,这些克隆共编码5种蛋白,主要为肋、迫相关蛋白与光系统相关蛋白。与这些蛋白的互作暗示Pc2参与了寄主植物症状的产生。