心肌细胞凋亡是导致多种心血管疾病发生、发展的重要细胞学基础,心力衰竭、病毒性心肌炎、心肌衰老等疾病均伴有广泛的心肌细胞凋亡发生。近年来研究发现,细胞膜内外离子通道的调控与细胞凋亡密切相关,在心肌细胞凋亡模型的研究中,应用全细胞膜片钳技术直接记录到类似于容积敏感性外向整流Cl-电流(volumesensitive outwardly rectifying chloride channel,VSOR),结合相关的生化指标,证明了阻断VSOR氯通道能有效的减轻心肌细胞损伤。目前已有VSOR氯离子通道与死亡受体(TNFR或Fas)或经线粒体介导细胞凋亡的研究报道。然而,有关VSOR氯离子通道与细胞凋亡的机制并未阐明。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞内蛋白质合成、脂质生成和钙离子贮存的主要场所。内环境的稳态以及高效运转,对于维持细胞的正常功能和存活非常重要。细胞内大约1/3功能蛋白的合成、正确折叠及结构成熟在ER内发生,在合成、折叠的同时伴随大量细胞膜内外离子通道的开放或关闭,其中最重要的阴离子通道氯离子通道和内质网胞浆内钙池中Ca2+离子内外交换,掌控着内质网的物质交换平衡,维持胞质内自稳态。一旦细胞内环境稳态遭到破坏,例如缺乏分子伴侣或细胞能量,Ca2+缺乏,氧化还原环境破坏,蛋白质变异和二硫键减少,导致蛋白质无法正确折叠。真核生物细胞通过一系列适应途径对内质网功能紊乱作出快速反应,称之为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。研究发现内质网应激状态对于细胞存活具有双重作用。早期内质网应激分子伴侣GRP78与内质网应激跨膜感受性蛋白PERK、ATF6和IRE1α受体蛋白解离,继而激活三个未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的效应器,发挥UPR的促细胞存活功能;过度的ERS经独立的信号途径致细胞发生凋亡。近年来,大量的研究证实ERS参与了多种心血管疾病的发生与发展,成为心血管疾病研究的新热点。那么,ERS作为新的凋亡途径,它是否也与VSOR氯离子通道共同参与细胞凋亡的发生呢?如果参与,二者在细胞凋亡过程中是否有相互调控作用?具体机制如何呢?目前国内外尚未有报道。本研究基于我们前期发现VSOR氯通道参与了心肌细胞凋亡的过程,阻断VSOR氯通道能有效的挽救心肌细胞凋亡性死亡的基础上,拟应用衣霉素(tunicamycin,Tm)在体内和体外两个水平构建内质网应激诱导的小鼠动物心力衰竭模型和心肌细胞凋亡模型,并进一步探讨:①氯离子通道是否参与了内质网应激诱导的细胞凋亡?在内质网应激水平持续加重时,阻断VSOR氯离子通道能否有效挽救细胞凋亡的发生?②VSOR氯离子通道与内质网应激相互之间如何调控?其分子机制?为治疗心血管凋亡相关性疾病提供全新的依据和策略。研究目的:1.构建衣霉素诱导内质网应激致小鼠心力衰竭与心肌细胞凋亡模型,探讨衣霉素造模最佳的量效、时效条件;2.探讨VSOR氯通道功能变化对衣霉素诱导内质网应激及细胞凋亡的影响;3.探讨在ERS过程中VSOR氯通道对心肌细胞内质网应激的信号通路调控与分子机制。研究方法:1.实验动物及工具药物:应用8周龄C57 BL/6雄性小鼠为实验对象。应用衣霉素构建经典的内质网应激模型;氯离子通道包括非特异阻断剂DIDS和VSOR氯离子通道特异性阻断剂DCPIB。2.实验分组:①原代心肌细胞模型分组:正常对照组、Tm组(100ng/ml)、Tm(100ng/ml)+DIDS(75 μM)组、DIDS(75 μM)组、Tm(100ng/ml)+DCPIB(2 μM)组、DCPIB(2 μM)组;②在体小鼠模型分组:假手术(Sham)组、Tm组、Tm+DIDS组、DIDS组、Tm+DCPIB、DCPIB 组。3.小鼠心力衰竭模型构建:衣霉素小剂量腹腔内注射,Tm浓度为3 mg/kg,DIDS浓度为14 mg/kg,DCPIB注射浓度为5 mg/kg,造模48小时后检测心肌细胞凋亡及小鼠心脏心功能变化。4.采用MTT法检测Tm对心肌细胞存活率的影响。5.应用TUNEL法、流式细胞仪及激光共聚焦显微镜技术观察心肌细胞凋亡情况。6.应用免疫印迹法检测内质网应激分子伴侣GRP78和CHOP表达;ERS信号通路相关蛋白ATF4、p-e IF2α、e IF2α表达水平,下游信号cleaved caspase-12、p-JNK、JNK、Bcl-2、Bax、Bax线粒体转位水平以及TRB3、p-Akt、Akt的表达水平。7.应用caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性。8.MQAE检测Tm对心肌细胞内氯离子浓度的影响。9.免疫荧光法检测心肌细胞GRP78/CHOP表达水平。10.实时定量PCR检测XBP 1S m RNA水平。11.应用CHOP基因沉默技术对H9C2细胞系进行转染,检测H9C2细胞总蛋白、胞浆、胞核β-catenin蛋白表达水平。采用双荧光报告系统检测β-catenin活性。研究结果:1.构建了理想的Tm诱导心肌细胞凋亡模型。衣霉素对心肌细胞存活率呈剂量及时间依赖性降低,流式结果显示Tm处理72 h细胞凋亡率最明显,达到32.4±4.1%(P<0.05,n=12),Tm100 ng/ml、作用72 h为造模最佳实验条件。衣霉素处理心肌细胞后内质网应激分子伴侣GRP78、CHOP的转录水平显著增加,24 h GRP78、CHOP m RNA表达至峰值,提示衣霉素是通过诱导内质网应激途径导致心肌细胞凋亡的发生。2.小鼠腹腔内注射衣霉素,48 h后小鼠心脏收缩功能显著降低。与假手术组Sham相比,衣霉素组左室射血分数由66.5±3.6%降至32.7±1.3%,差异有统计学意义(P<0.05,n=5)。构建了理想的衣霉素诱导心脏心力衰竭模型。3.心肌细胞存活率在衣霉素组、DIDS和DCPIB组分别是57.4±3.18%、80.4±1.2%和78.4±0.8%;心肌细胞内caspase-3活性在衣霉素组、DIDS和DCPIB组分别是88.4±3.4%、45.6±1.2%和42.1±2.6%;与衣霉素组相比,DIDS和DCPIB组在细胞存活率及caspase-3活性组间差异具有统计学意义(P<0.05,n=5),提示DIDS和DCPIB组能够显著抑制caspase-3活性及细胞凋亡的发生。4.反映细胞内氯离子浓度的MQAE荧光强度在正常对照组、衣霉素组及DIDS组分别是0.9±0.18、11.3±0.7和3.6±0.4;与正常对照组相比,衣霉素组MQAE荧光强度显著升高,两组差异具有统计学意义(P<0.05,n=5);与衣霉素组相比,DIDS组MQAE荧光强度显著下降,二组差异具有统计学意义(P<0.05,n=5)。结果提示MQAE荧光强度能够反映细胞内氯离子浓度水平,其强度与氯离子浓度呈负相关,DIDS能够显著抑制氯离子外流。5.信号分子ATF4、CHOP和p-e IF2α/e IF2α在正常对照组、衣霉素组、DIDS组和DCPIB组中的表达分别约是1、2.5、1.5和1.25倍,与正常对照组相比,衣霉素组中各指标显著增加,有统计学差异(P<0.05,n=5);而与衣霉素组相比,DIDS和DCPIB组上述指标显著降低,有统计学差异(P<0.05,n=5);提示DIDS和DCPIB组能够显著抑制ATF4、CHOP和p-e IF2α/e IF2α蛋白表达(P<0.05,n=5)。6.信号分子p-JNK、JNK通路蛋白在正常对照组、衣霉素组、DIDS组中表达,各组间相比,均无显著性差异(P>0.05,n=5),表明内质网应激信号通路相关蛋白JNK的活化不受DIDS的影响。7.XBP 1S m RNA转录水平在正常对照组、衣霉素组、DIDS组和DCPIB组中分别为1、0.5、0.85和0.88倍;与正常对照组相比,衣霉素组XBP 1S m RNA显著下降,有统计学差异(P<0.05,n=5);而与衣霉素组相比,DIDS和DCPIB组XBP1S m RNA显著增加,有统计学差异(P<0.05,n=5);提示DIDS和DCPIB能够显著增加心肌细胞内XBP 1S m RNA转录水平。8.凋亡相关基因Bcl-2/Bax蛋白比值在正常对照组,衣霉素组、DIDS组中分别是1、0.6,1.25倍,与正常对照组相比,衣霉素组Bcl-2/Bax蛋白比值明显下降,有统计学差异(P<0.05,n=5);而与衣霉素组相比,DIDS组Bcl-2/Bax蛋白比值上升,二者相比差异具有统计学意义(P<0.05,n=5)。与衣霉素组相比,DIDS组cleaved caspase-12蛋白表达下降近1倍,具有统计学意义(P<0.05,n=5)。提示DIDS能够显著增加心肌细胞内Bcl-2/Bax蛋白表达水平,并可以减少内质网应激促凋亡蛋白cleaved caspase-12表达。9.Wnt相关蛋白β-catenin在正常情况下细胞核内呈现一定表达水平而发挥功能,而衣霉素处理24 h后,细胞核内β-catenin水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05,n=5),提示衣霉素导致β-catenin核转位明显减少;si CHOP时Topflash荧光读数是阴性组及正常对照组的3倍,差异具有统计学意义(P<0.05,n=5)。提示干涉CHOP基因时β-catenin活性显著升高,表明CHOP对Wnt蛋白具有调控作用。10.Topflash荧光素酶报告系统观察β-catenin活性水平,荧光读数在对照组、衣霉素组、si CHOP、DIDS和DCPIB分别是1、0.5、0.8,0.9和0.85。与正常对照组相比,衣霉素组β-catenin活性显著降低,具有统计学意义(P<0.05,n=5);而与衣霉素组相比,si CHOP、DIDS、DCPIB组β-catenin活性显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05,n=5),提示DIDS和DCPIB能够抑制衣霉素诱导的Wnt活性下调。11.通过si CHOP转染预处理并衣霉素干预,分别检测β-catenin活性在阴性对照组、衣霉素组、DIDS组和DCPIB组的变化,结果显示DIDS或DCPIB处理后,对衣霉素诱导的β-catenin活性降低无明显改善(P>0.05,n=5),从另一方面提示阻断CHOP后,DIDS或DCPIB丧失了对β-catenin活性的调控作用,进一步反映Wnt是CHOP下游分子。特别是使用Wnt信号通路抑制剂s FRP后,DIDS或DCPIB同样失去了对β-catenin活性的调节,差异有统计学意义(P<0.05,n=5)。提示沉默CHOP信号通路后或Wnt信号通路直接阻断后,氯离子通道阻断剂不能调控β-catenin活性的表达。12.心肌细胞存活率在衣霉素组、si CHOP、DIDS和DCPIB组分别是56.8±7.23%、74.4±5.2%、76.6±3.1%和77.8±5.8%;与衣霉素组相比,si CHOP、DIDS和DCPIB组在细胞存活率显著增加,组间差异具有统计学意义(P<0.05,n=12)。而s FRP抑制Wnt通路后,导致si CHOP、DIDS或DCPIB丧失了细胞保护作用。提示si CHOP、DIDS和DCPIB组能够显著抑制衣霉素导致的细胞凋亡,其保护作用可被s FRP阻断,说明Wnt信号通路是CHOP下游的调控分子。结论:1.衣霉素可通过诱导内质网应激导致心肌细胞凋亡的发生,进一步在小鼠体内证实衣霉素诱导内质网应激可明显损伤心肌收缩功能;氯通道阻断剂DIDS、DCPIB能够有效地减轻衣霉素诱导内质网应激性心肌细胞凋亡及改善在体心脏受损的心功能。2.衣霉素是通过调控p-e IF2α/ATF4和XBP1蛋白通路,增加了促凋亡基因CHOP的生成而非JNK通路诱导内质网应激反应。DIDS、DCPIB能够通过抑制该途径减少了促凋亡基因CHOP的生成;同时DIDS也能够显著增加心肌细胞内Bcl-2/Bax蛋白表达水平,并可以减少内质网应激促凋亡蛋白caspase-12表达,达到保护心肌细胞的作用。3.CHOP信号通路对Wnt信号通路有明显的调控作用,Wnt通路是其下游分子,DIDS或DCPIB组能够显著抑制衣霉素对Wnt相关蛋白β-catenin的下调作用,该作用可被s FRP所阻断。氯离子通道阻断剂发挥抗凋亡的保护效应是通过CHOP/Wnt信号通路介导的。