研究背景射频消融(radiofrequency ablation, RFA)是热消融的一种,它通过射频发生器发出一定频率的交变电流,激发电极针周围组织中离子剧烈震动、摩擦产热,使肿瘤组织发生完全凝固性坏死的同时彻底破坏肿瘤微循环血供从而达到杀伤肿瘤的作用。RFA治疗具有操作简单、可重复实施、疗效确切、创伤性小等优点,目前已成功运用于肝、肾、肺、子宫附件、甲状腺、乳腺等脏器肿瘤的微创治疗。然而RFA治疗肿瘤效果不一,局部复发率可达到4%-78%不等。治疗后残余肿瘤组织是导致肿瘤复发的主要原因,因此尽可能大地扩大消融范围以彻底灭活肿瘤细胞、完全阻断其微循环血供是减少肿瘤复发的有效方法。目前用于扩大射频消融范围的方法主要有增加组织局部热能沉积、提高组织的热传导性、降低组织对热能的耐受以及减少组织局部热能损失等。近年来,一种新型包裹液态氟碳的纳米级超声造影剂在疾病诊断以及肿瘤靶向治疗方面受到越来越多学者的关注。纳米级粒径范围的超声造影剂进入机体后更容易逃脱机体网状内皮系统的清除作用,在体内循环时间更长,更容易穿透肿瘤血管屏障并通过渗透和滞留增强效应在肿瘤组织间隙内蓄积。同时,包裹液态氟碳的超声造影剂具有液-气相变潜能,在外界条件作用下(如超声波、温度、激光、细针注射等)可发生相变,伴随着纳米粒体积增大、二维回声增强等表现。近年来有研究发现包裹液态氟碳的超声造影剂联合高强度聚焦超声(HIFU)消融可有效增强能量沉积,减少局部热能损失,进而扩大消融范围。多数学者认为液态氟碳的热致相变作用是增效HIFU消融效果的直接原因。RFA与HIFU的消融机制同属热消融治疗,理论上包裹液态氟碳的超声造影剂在RFA作用下同样可产生热相变作用,而关于包裹液态氟碳的超声造影剂对射频消融治疗效果的影响还鲜见报道。研究目的本项目首先拟制备一种包裹液态全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)的纳米级超声造影剂,检测PFH纳米粒的理化性质,然后通过体外实验验证PFH纳米粒的相变潜能；最后通过动物实验探讨PFH纳米粒对RFA效果的影响,从超声造影、病理、肿瘤生长率等方面观察纳米粒的射频消融增效作用。材料与方法一、仪器与试剂实验仪器：电子天平(CP2225D型,北京赛多利斯仪器系统有限公司)；恒温水浴锅(DK—S22型,上海精宏实验设备系统有限公司)；高速分散剪切机(T25基本型,德国IKAULTRA-TURRAX); ATS高速分散均质机(AH-2010);Malvern激光粒度分析仪器(Nano-IS&MPT-2);库尔特浓度分析仪(MultisizerⅢ);扫描电子显微镜(S-3000N,HITACHI); C02恒温培养箱(Thermo Fisher, USA)、超净工作台(广州芯康医疗科技有限公司),离心机(Thermal Fisher, USA),酶标仪(SpectraMax M5,USA);射频治疗仪(RITA, USA),设定功率35W、温度100℃、单针消融时间2.0mmin,电极针17Gx10cm; Olympus Celon AG型射频治疗仪(Celon公司),脚踏启动,消融功率5 W,配有18 G×10 cm单针双极式射频针,针尖温度60-80度；iU22彩色多普勒超声诊断仪,L12-5高频线阵探头,频率9.0～12.0MHz,配有超声造影模式(Philips公司)。主要试剂：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC, Avant Polar Lipid)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA, Avant Polar Lipid)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DPPE-PEG5000, Avant Polar Lipid)、全氟己烷液体(PFH, Apolo公司)；1,2-丙二醇、甘油、NaCl粉末、琼脂粉末(北京百灵威化学试剂有限公司)、蒸馏水；MTT(碧云天生物科技有限公司)、DMSO(Sigma公司)、PRM-1640(Hyclone公司)、胎牛血清(FBS,Hyclone公司)、磷酸盐缓冲液(PBS,碧云天生物科技有限公司)、0.25%胰蛋白酶(碧云天生物科技有限公司)；声诺维SonoVue(Bracco公司)；速眠新Ⅱ注射液,阿托品,3%戊巴比妥钠,肝素。二、PFH纳米粒的制备及理化性质检测1.纳米粒的制备采用均质-乳匀法制备纳米粒。按摩尔比称取一定量的DPPC、DPPE-PEG5000以及DPPA,加至丙二醇溶液中使完全溶解,再加入一定量的甘油和NaCl水溶液,于70℃水浴顺时针震荡至完全溶解,制成磷脂分散液。将上述磷脂分散液加入50 mL聚丙烯管内,冷却后加入PFH,冰浴条件下剪切(频率24000 r min一1、时间3 min),制得包裹PFH的初乳,再将初乳置于高速分散均质机乳匀,设置均质压力及次数,制得包裹PFH的纳米粒。2.纳米粒理化性质检测取制备好的纳米粒经超纯水适当稀释后,马尔文激光粒度分析仪检测纳米粒粒径范围、电位及多分散系数；扫描电子显微镜观察纳米粒表面形态；库尔特分析仪检测浓度。三、包裹PFH纳米粒生物相容性检测1.细胞增殖活性检测采用甲基噻唑基四唑(MT,T)法检测PFH纳米粒对结肠癌细胞SW480增殖活性的影响。取对数生长期的SW-480细胞,经胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的PRMI-1640细胞培养液稀释制成细胞浓度约为5×104个/ml的细胞悬液备用。取100ul细胞悬液至96孔培养板,37-C培养24h后细胞贴壁生长。取出96孔板,按浓度(0--1.2×109个/ml,用无血清的培养基稀释)加入PFH纳米粒后放入C02培养箱中继续培养24h。继而向各孔分别加入10ul MTT溶液(5mg/mL),37-C继续培养4 h,弃除上清液。每孔分别加入150ul二甲基亚砜(DMSO),摇床震荡10 mmin。酶标仪490 nm波长处测各孔光密度(OD)值。2.体外溶血试验自新西兰白兔耳缘静脉采血10ml置于离心管内,肝素化(棉签不断搅拌)以除去纤维蛋白,1500r/min离心1 5min,弃上清,再加入生理盐水洗涤,均离心后弃上清,多次离心直至上清液无红色,取沉淀,用生理盐水配成2%的红细胞混悬液,备用。离心管7支,编号,每管内溶液总量为5m1,每管内依次加入2%红细胞混悬液2.5 ml。1-5号管为实验组,每管内依次加入不同量(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL)的PFH纳米粒溶液及5%的葡萄糖溶液定容。6号管为阴性对照,加入2.5ml5%葡萄糖溶液,7号管为阳性对照,加入2.5ml蒸馏水。混匀后,置于37℃恒温水浴锅中,观察并记录各管的溶血情况。四、PFH纳米粒体外相变1.水囊加热取上述制备好的PFH纳米粒溶液2ml、脱气水120 ml混匀稀释后备用。取100 ml稀释纳米粒溶液、100ml脱气水分别装于两个特制小囊中并密封,将两个小囊置于不同温度水浴箱中同时行二维超声显像,采集动态图像并存储。2.琼脂模型射频消融称取6 g琼脂粉溶于400 ml沸水并分装于两个容器中,待温度降至40℃时,取2ml稀释纳米粒溶液及2ml脱气水分别加入琼脂混悬液中,玻璃棒轻微搅拌至完全混匀,常温下静置60min待其完全凝固后备用。超声引导下分别对琼脂块行射频消融,用瑞达射频仪,设定功率35 w,时间2.0 min,设定温度100℃,其实际温度可以达到87℃,二维超声实时动态观察消融区回声改变。五、PFH纳米粒影响兔VX2瘤射频消融效果1.实验动物模型建立健康新西兰大白兔40只,雌雄不拘,体质量2.5～3.0kg,由南方医科大学附属南方医院实验动物中心提供。VX2瘤组织悬液由广州中山大学实验动物中心提供。取VX2瘤组织悬液1ml接种至传代兔右后肢外侧肌层内组织内。接种后常规观察肿瘤生长情况,2周左右瘤组织进行传代。使用速眠新Ⅱ(0.3ml/kg)、阿托品注射液(0.2ml/kg)对传代兔行肌注麻醉满意后,建立兔耳缘静脉通道,使用3%戊巴比妥钠(0.2ml/kg)对传代兔行静脉麻醉。传代兔侧卧位固定于实验台上,脱毛,充分暴露荷瘤区,消毒,无菌条件下取出肿瘤组织并迅速剔除周边结缔组织及中央坏死区,将剩余的新鲜鱼肉样组织置于无菌生理盐水中,眼科剪将其剪成lmm3的小块,分别接种至40只健康新西兰大白兔右后肢外侧肌层内。常规超声监测肿瘤生长情况,约15天左右,超声测量肿瘤最大切面直径为1.0～1.5 cm时,兔肌层VX2肿瘤模型建立成功,备用。2.实验分组将肿瘤种植成功的36只荷瘤兔随机分成3组,每组12只。实验组包括单纯RFA治疗组(I组),纳米粒+RFA治疗组(Ⅱ组)；对照组(Ⅲ组)为空白对照组。I组,经耳缘静脉推注0.4 ml/kg的生理盐水(0.9%)联合RFA治疗。Ⅱ组,经耳缘静脉推注0.4 ml/kg纳米粒联合RFA治疗。用Olympus Celon AG型射频治疗仪,脚踏启动,消融条件一致,单针消融。Ⅲ组,不做任何处理,仅为空白对照。3.超声检查常规超声观察实验组治疗前后及对照组肿瘤回声情况,轨迹法勾画肿瘤最大切面面积(A0)。超声造影观察各组肿瘤治疗前后造影剂灌注情况,储存动态造影图像,选取造影缺损区最大切面,轨迹法勾画造影缺损区面积(AD)。4.病理观察治疗后每组随机抽取3只荷瘤兔,空气栓塞法处死,沿针道切开肿瘤,观察肿瘤及消融灶的肉眼改变。将各组切取的肿瘤组织固定,脱水,包埋,切片,HE染色,光镜观察各组肿瘤组织坏死情况。5前中瘤生长情况观察常规超声动态观察27天肿瘤生长情况,每隔3天测量肿瘤面积,绘制肿瘤生长曲线。计算肿瘤生长率,比较各组差异。肿瘤生长率采用公式X27(%)=100%×(A27-A0)/A0计算(X27：治疗后27天肿瘤相对生长率；A27：第27天肿瘤面积；AO：处理前肿瘤面积)。六、统计学分析采用SPSS 20.0统计学分析软件,计量资料采用均数±标准差表示。各组间统计结果的比较用one-way ANOVA,各组间两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、PFH纳米粒的一般特性制备好的纳米粒为白色乳状液,短时间静置后未见明显分层现象；扫描电子显微镜下可见纳米粒呈圆球形,表面尚光滑,分布基本均匀,彼此无明显聚集现象；Malvern激光粒度分析仪器测得纳米粒平均粒径为(288.7±36)nm,电位为(-2.44+0.18)mV,多分散系数为0.0622±0.014；库尔特浓度分析仪测得纳米粒浓度为1.2×109个/ml。二、PFH纳米粒生物相容性检测1.细胞增殖活性影响在实验中给定的PFH纳米粒浓度范围(0-1.2×105个/ml)内,结肠癌SW480细胞的增殖活性未见明显改变,各组OD值差异无统计学意义。2.体外溶血试验阳性对照组表现为管内液体为橙红色,管底未见明显红细胞。葡萄糖稀释的不同浓度纳米粒组以及阴性对照组在15、45、90、180mmin均未发生溶血及红细胞凝集现象,表现为管内红细胞完全下沉,上层液体为无色透明。三、PFH纳米粒体外相变实验1.水囊加热超声显影效果加热前,二维超声可见PFH纳米粒组、脱气水组回声均极低,接近无回声,回声强度分别为(0.18±0.04)dB.(0.23±0.09)dB;加热至78℃时,PFH纳米粒组水囊内有较多气体样强回声产生,由底部向上运动,回声较加热前明显增强,而脱气水组水囊内未见明显气体产生,回声较加热前无明显改变,回声强度分别为(26.49±0.71)dB.(0.25±0.05)dB;加热前、后二维回声强度比较,PFH纳米粒组差异具有统计学意义(P<0.05),脱气水组差异无统计学意义(P=0.46)。2.琼脂模型射频消融启动射频消融前,PFH纳米粒组及单纯琼脂组均表现为无回声；启动消融后当射频针温度达到额定温度时,PFH纳米粒组射频针周围可见明显高回声区形成,而单纯琼脂组射频针周围仅见少许点状高回声散在分布。四、PFH纳米粒影响兔VX2肿瘤射频消融效果1.VX2移植瘤模型建立1只瘤兔在实验中因麻醉过量死亡,3个移植瘤治疗前超声造影显示有大范围坏死,均被排除实验。用于实验的36个移植瘤平均面积66.56±3.16mm2,,组间未见统计学差异(P=0.10)。2.超声表现常规超声示治疗前,移植瘤均表现为低回声结节、呈类圆形、边界较清；治疗后实验组均形成消融灶,表现为不均匀低回声区、内有点状强回声散在分布,对照组无消融灶形成,回声无明显改变。超声造影示治疗前,各组移植瘤内均有造影剂灌注,部分移植瘤中央有小范围造影缺损区,面积为(5.32±1.73)mm2,组间无统计学差异(P>0.05)；治疗后实验组(Ⅰ、Ⅱ组)肿瘤组织内均出现大范围造影缺损区,对照组(Ⅲ组)肿瘤组织内未见明显造影缺损区。治疗后各组造影缺损区面积分别为：Ⅰ组(41.46±2.70)mm2、II组(62.33±1.59)mmm2、Ⅲ组(5.22±1.61)mmm2,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.病理表现肉眼及光镜下均证实实验组靶区肿瘤组织发生不可逆坏死,而对照组无明显坏死。①肉眼下,实验组(Ⅰ、Ⅱ组)消融区均有椭球形坏死灶形成,为灰白色、质硬、缺乏弹性,中央可见窄条状针道,与邻近组织分界清楚；对照组肿瘤区未见明显坏死灶,肿瘤呈灰白色鱼肉状,质地较紧密,富有弹性(图3-1)。(②光镜下,实验组(Ⅰ、Ⅱ组)消融区与肿瘤组织有明显分界,消融区显示肿瘤细胞核固缩,胞浆疏松,散在微小血管显著扩张,肿瘤间质内可见溢出的红细胞,形成不规则血栓,呈局灶性分布；对照组肿瘤细胞排列紧密,大小不一,形状各异,无明显细胞固缩现象。4.肿瘤生长情况治疗后27天,各组肿瘤生长率分别达到Ⅰ组：160.61±16.06%、Ⅱ组：57.04±9.88%、Ⅲ组：308.08±22.90%,三组比较差异有统计学意义,PFH纳米粒联合RFA治疗组肿瘤生长率显著低于单纯RFA治疗组以及空白对照组(P<0.05)。结论1.本实验以DPPC.DPPE-PEG5000.DPPA为成膜材料、以液态PFH为被包裹材料,采用均质-乳匀法制得了浓度较高、粒径均匀且为纳米级的脂质微球混悬液。2.本实验制得的PFH纳米粒具有良好的生物相容性,无明显生物毒性,为以后应用于临床奠定了基础。3.本实验制得的纳米粒由于其内包裹特殊的生物材料—液态全氟己烷,因而具有热相变潜能,即由液态转变为气态,同时在常规二维超声上表现为高回声。4.本实验通过兔VX2瘤射频消融实验证实,消融过程中加入制备的PFH纳米粒可明显扩大消融范围,增加消融效果。