背景自1887年Oddi括约肌(sphincter of Oddi,SO)被发现以来,人们对其结构及功能的认识也不断深入,且清楚地认识到其对胆胰正常功能的维持具有重要的作用。我们在前期的一系列研究发现SO的解剖及功能异常与多种胆胰疾病有关,如原发胆管色素结石、胆囊切除术后综合征、先天性胆胰管合流异常、急性胰腺炎及Oddi括约肌功能障碍(sphincter of Oddi dysfunction,SOD)等。由于SO特殊的解剖位置及生理功能,目前对其功能调控的基础研究明显滞后。内镜下SO切开(endoscopic sphincterotomy,EST)对于SOD的治疗的近期效果满意,但是EST相关并发症及其后肠胆反流的发生仍是临床上难以解决的问题。SO的自主动力本质上是肌源性的,存在多种神经以调节其运动,同时协调SO运动与十二指肠,胆囊和胃的运动。SO动力的改变可能是来自于神经和生物活性物质在平滑肌水平上的信号的整合,SO中兴奋的起源和传导机制仍不清楚。已描述在胃肠道中存在产生摆动性电活动的特殊的起搏细胞,即Cajal样细胞(interstitial Cajal-like cells,ICLCs),产生独特的电模式驱动慢波在这些细胞内的传播。ICLCs缺失与肠慢波活动消失相关。我们在前期对豚鼠胆囊动力的研究中发现,胆囊组织中存在与胃肠道内Cajal细胞形态功能相似的间质细胞称为Cajal样间质细胞(interstitial cajal-like cells)ICLCs,去除ICLCs的胆囊肌条慢波频率、振幅和肌张力均显著下降,提示ICLCs在调节胆囊动力中起重要作用。SOD是无显著病理解剖情况下的SO动力功能失调引起的腹痛、肝脏或胰酶升高、胆道扩张或胰腺炎发作。国内外近20年的研究逐渐认识到,SOD与胆道系统诸多疾病的发生密切相关。我们在前期工作中通过内镜下SO测压发现,SOD患者的SO基础压力升高,收缩幅度变大,收缩频率加快。这样的结果提示我们SO兴奋性升高是SOD发生的重要环节。膀胱过度活动症患者逼尿肌中c-kit阳性ICLCs较正常逼尿肌明显增多,平滑肌细胞之间过多的电偶联可以解释逼尿肌兴奋性增高的现象,并提出c-kit阳性ICLCs可能成为膀胱过度活动症的治疗靶点。我们从泌尿系的研究结果中得到启发,SOD中亦存在SO的过度活动。于是我们推测:SO中若存在ICLCs,SOD情况下SO张力增高可能通过影响ICLCs实现的,SOD情况下ICLCs是否发生改变,若有改变,这种改变是否与SO的过度活动有关。c-kit是ICLCs的特异性标记物,属于受体酪氨酸激酶家族第三亚类,其与配体干细胞因子(stem cell factor,scf)结合后所启动的信号通路在ICLCs的发育、分化及表型维持中起重要作用。自发性c-kit突变的动物,如W/Wv小鼠及Ws/Ws大鼠白色斑点基因位点(为c-kit的等位基因)突变,因c-kit的活力明显下降,而致ICLCs不能正常发生及发育。这充分说明c-kit在ICLCs发生、发育及表型维持中具有重要的作用。我们推测:SOD中若存在ICLCs改变,这种改变可能与c-kit及scf基因异常表达有关。综合前面证据与假说:本研究分为三部分内容进行探讨。第一部分:提供SO中存在ICLCs的形态学和生理学证据;第二部分:去除ICLCs后SO肌电生理活动是否发生改变,ICLCs的形态、数量是否发生改变;第三部分:SOD中若存在ICLCs改变,这种改变是否与c-kit及scf基因异常表达有关。从一个全新的视角阐述SO的运动模式以及SOD的发病机制。研究方法:1.免疫荧光化学染色观察c-kit阳性细胞与SMC及神经纤维的关系:选取健康成年豚鼠10只,制备豚鼠壶腹部全层铺片,分别用c-kit酪氨酸激酶免疫荧光化学染色、SMA免疫荧光化学染色、PGP9.5免疫荧光化学染色显示ICLCs、SMC以及神经纤维,通过激光共聚焦显微镜观察三者之间的关系。2.透射电镜观察豚鼠SO内ICLCs形态学特征:健康成年豚鼠10只,制备豚鼠壶腹部超薄切片,透射电镜观察ICLCs与SMC以及神经纤维的关系。3.评价豚鼠ICLCs破坏前后SO肌电力改变:45只成年豚鼠,记录生理状态下豚鼠SO肌电活动变化,生理状态下肌电活动监测结束后,与亚甲蓝、532nm兰光反应,检测ICLCs破坏对oddi括约肌肌电力的影响。4.观察ICLCs破坏后豚鼠SO内ICLCs的形态学改变:(1)15只成年豚鼠,分为对照组、亚甲蓝染色组、亚甲蓝+兰光照射组进行肌电力检测。(2)利用透射电镜观察ICLCs是否发生形态学改变。5.观察亚甲蓝、兰光干预后豚鼠SO内ICLCs的数量改变(1)15只成年豚鼠,分为对照组、亚甲蓝染色组、亚甲蓝+兰光照射组进行肌电力检测。(2)利用免疫荧光观察ICLCs是否发生数量改变。6.检测亚甲蓝、兰光干预后豚鼠SO内c-kit、scf蛋白表达量的改变(1)15只成年豚鼠,分为对照组、亚甲蓝染色组、亚甲蓝+兰光照射组进行肌电力检测。(2)利用Western-blotting检测c-kit、scf的蛋白表达是否发生改变。7.豚鼠SOD模型的建立:60只成年豚鼠随机分为两组,对照组行开腹探查术,SOD模型建立组行胆囊切除术。饲养30日后对两组豚鼠分别进行SO压力检测,进行比较。。8.免疫荧光检测豚鼠SOD状态下c-kit阳性细胞计数:免疫荧光对对照组及实验组SO压力、频率明显改变的豚鼠进行c-kit阳性细胞定位及表达情况测定。利用ImagJ软件进行细胞计数。9.检测两组中豚鼠SO组织c-kit、scf表达水平采取Western-blotting方法检测对照组及实验组SO压力、频率明显改变的豚鼠SO组织中c-kit、scf的蛋白表达量。10.观察两组豚鼠SO超微结构的改变透射电镜观察对照组及实验组SO压力、频率明显改变的豚鼠SO组织超微结构的改变。结果:1.免疫荧光化学染色观察c-kit阳性细胞与SMC及神经纤维的关系:免疫荧光化学染色显示有大量的c-kit阳性表达的ICLCs存在于豚鼠SO组织中,并分布于平滑肌肌层或肌束。可见PGP9.5阳性表达的神经纤维存在于SO组织中,其周围分布ICLCs。2.透射电镜观察豚鼠SO内ICLCs形态学特征:透射电镜观察到在豚鼠SO组织中,有呈纺锤形、向外伸展突起的ICLCs广泛分布。其细胞核周围胞质较少,有丰富的线粒体、核糖体,大量粗面内质网、光面内质网。并且ICLCs与神经纤维紧密相连,其间可见高电子致密度的轴芯和电子致密度低的囊泡,提示在解剖及功能上密切相关。ICLCs相邻与SMC,其二者呈平行关系,形成疏松的网状结构。3.评价豚鼠ICLCs破坏前后SO肌电力改变:针式吸附电极记录到豚鼠离体SO峰电位活动波形具有较好的一致性,多为双向波,生理状态下豚鼠SO肌电活动呈规律的波形图,15只豚鼠振幅在0.63±0.07mV,频率为27.9±1.91次/min。经亚甲蓝染色组我们可以发现SO仍有肌电活动,振幅频率26.81±1.87(次/min),振幅0.61±0.06mV,与对照组相比无明显改变。亚甲蓝与兰光破坏ICLCs组的15只豚鼠,我们可以发现SO肌电活动基本消失,振幅为0.16±0.03mV,频率为9.92±1.52次/min。经统计学分析,ICLCs破坏组与对照组及亚甲蓝染色组振幅和频率具有显著差异(P<0.05)。4.观察ICLCs破坏后豚鼠SO内ICLCs的形态学改变:在结果2中我们在电镜下观察到正常ICLCs的形态学特征。而以甲基蓝染色+兰光照射的方式处理豚鼠SO后,可以看到,与正常组相比,甲基蓝染色组ICLCs超微结构无异常,平滑肌细胞无明显结构异常。甲基蓝+兰光组可见:细胞明显肿胀,线粒体肿胀明显,细胞质膜内多发空泡变性伴破裂,但平滑肌细胞未受影响。5.观察亚甲蓝、兰光干预后豚鼠SO内ICLCs的数量改变:经甲基蓝+兰光干预后的c-kit阳性细胞表达量低于正常组。Image J进行细胞计数后得到结果显示c-kit阳性细胞计数Count(93±9.5 vs 53.7±8.3,对照组vs实验组,P=0.060),细胞体积Average Size(231.943±7.611 vs 231.227±14.80,对照组vs实验组,P=0.919),总体积Total Area(24518.47±2304.32 vs 12453±1796.21,对照组vs实验组,P<0.05)。在甲基蓝+兰光干预因素状态下,c-kit阳性细胞数量降低,虽不具有统计学意义。6.检测亚甲蓝、兰光干预后豚鼠SO内c-kit、scf蛋白表达量的改变:Western-blotting检测甲基蓝加兰光染色干预豚鼠SO后,其c-kit及scf蛋白表达水平下降。其灰度值分析结果显示P<0.05,具有统计学意义。7.豚鼠SOD模型的建立:对照组30只豚鼠行开腹探查手术后,饲养30天存活率为100%,实验组30只豚鼠行胆囊切除后饲养30天存活率为65%。实验组动物术中死亡2例,死亡原因1例为术中触碰肝动脉导致出血死亡,1例为术中麻醉过量死亡。术后饲养过程中死亡为6例,死亡时间为术后8.16d(6d-12d),死亡原因为:腹腔感染,术后应激等原因。4例实验组动物在干预给予并饲养30天后进行测压,其压力结果与对照组相比无明显改变,并未纳入SOD标准。最终实验组共纳入数量为18只,对照组纳入数量为18只。测压结果显示:对照组SOBP为7.98±2.31mmHG;SOCA为31.26±9.47mmHG;SOF为4.32±1.75次/分。胆囊切除、胆总管部分结扎组SOBP为24.87±8.34mmHG;SOCA为43.67±12.38mmHG;SOF为6.74±2.19次/分。8.免疫荧光检测豚鼠SOD状态下c-kit阳性细胞计数:结果可见实验组c-kit表达量优于对照组Image J进行细胞计数后得到结果为c-kit阳性细胞计数Count(67.7±9.3 vs 96.7±13.1,对照组vs实验组,P<0.05),细胞体积Average Size(188.913±21.876 vs 212.284±19.641,对照组vs实验组,P=0.174),总体积Total Area(16288.53±2093.21 vs 22647.86±1904.32,对照组vs实验组,P<0.05)。9.检测两组中豚鼠SO组织c-kit、scf表达水平:与正常组比较,SOD组c-kit表达明显升高,scf表达明显升高。利用Image J软件分析吸光灰度值,结果所得:c-kit蛋白表达(0.6782±0.1325 vs 0.3649±0.0981,P<0.05,实验组vs对照组),scf蛋白表达(0.2913±0.0431 vs 0.1276±0.0328,P<0.05,实验组vs对照组),结果具有统计学意义。10.观察两组豚鼠SO超微结构的改变:SOD状态下ICLCs无明显改变,而平滑肌细胞则表现为功能亢进。可见较多密斑、密体形成并分布与平滑肌间,其作为收缩单位的增加解释了ICLCs数量的增多。结论:1.本研究表明,在豚鼠壶腹部平滑肌肌层及肌层之间存在大量的ICLCs,且这些细胞与胃肠道内的ICLCs具有相似的形态学特征。本实验观察到豚鼠oddi括约肌内ICLCs与平滑肌细胞及神经纤维连接紧密,其分布具有一定的规律性,可能提示了oddi括约肌中ICLCs与平滑肌细胞以及神经纤维存在的电偶联机制。2.我们通过对SO肌电活动的记录发现,其波形较规律,与胃肠道的自发性肌电活动相似。本实验肌电活动部分采取离体记录的方式,通过加入TTX的方法阻断了钠离子通道,从而阻滞了由神经冲动引起的动作电位,因而可以肯定,实验记录的肌电活动是自发性的肌电活动,而不是神经纤维引起的。3.在通过亚甲蓝反应与532nm可调聚光灯照射破坏ICLCs后,我们发现ICLCs破坏后豚鼠SO自主节律性活动消失,与正常SO组织运动的平台期相符。这提示了ICLCs作为SO的运动起搏细胞,其破坏影响了SO的自主节律性收缩。4.在通过亚甲蓝反应与532nm可调聚光灯照射破坏ICLCs后,我们发现ICLCs破坏后豚鼠SO自主节律性活动消失,与正常SO组织运动的平台期相符。这提示了ICLCs作为SO的运动起搏细胞,其破坏影响了SO的自主节律性收缩。5.豚鼠SO与亚甲蓝+兰光反应后细胞明显肿胀,线粒体肿胀明显。细胞质膜内多发空泡变性伴破裂。但平滑肌细胞未受影响。本实验显示,亚甲蓝加蓝光可以选择性地破坏豚鼠胆囊中的ICLCs,而对平滑肌细胞没有影响。6.甲基蓝加兰光染色干预豚鼠SO后,其c-kit及scf蛋白表达水平下降。提示我们亚甲蓝+兰光干预下不仅对ICLCs的结构造成了影响,同时减少了ICLCs的数量。7.SOD组与正常组c-kit蛋白表达情况,SOD组c-kit表达明显升高。SOD组与正常组scf蛋白表达情况,SOD组scf表达明显升高。说明了在SOD状态下SO组织中ICLCs的数量发生显著增加。8.SOD形成过程中,我们发现实验组豚鼠SO基础压(SOBP)显著增高,且与对照组相比较具有统计学差异。而收缩压(SOCA)与收缩频率(SOF)也有明显的呈增高趋势的变化,但并不具有统计学差异。9.SOD形成过程中,对照组的密斑、密体明显增多,表明虽然胆囊切除术后豚鼠SO平滑肌细胞骨架中的肌丝结构发生了变化,肌丝及其附着点的数量增加,这种变化同样反映出胆囊切除术后由于神经和体液调节的变化,SO平滑肌收缩能力有所增加。10.SOD形成过程中,实验组免疫荧光结果显示c-kit阳性细胞计数多于对照组,证实了SOD状态下ICLCs的数量增多。解释了SO的过度收缩压力。