基于免疫分析的黄曲霉毒素M1和呕吐毒素高灵敏快速检测方法研究

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真菌毒素是农产品在生产、存储、运输及加工过程中由产毒真菌产生的次级代谢产物。黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)、呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)是两种常见的真菌毒素。AFM1主要存在于牛奶及乳制品中,DON主要存在于粮食、饲料和食品中。人类和动物误服真菌毒素超标的农产品后容易导致脏器损伤、生殖异常、免疫抑制、器官癌变等。因此,建立快速、便捷、高灵敏度、特异性高的农产品中真菌毒素检测方法对于政府监管和保障消费安全具有重大意义。本论文建立了两种基于免疫分析的快速检测方法,主要研究内容如下:(1)基于氧化石墨烯-壳聚糖(graphene oxide-chitosan,GO-CS)/二氧化铈-壳聚糖(cerium dioxide-chitosan,Ce O2-CS)纳米复合材料修饰的AFM1电化学免疫传感器的制备及应用。首先,将制备的GO-CS和Ce O2-CS逐层修饰在丝网印刷电极(Screen printed electrodes,SPEs)表面,以放大其电化学信号。利用氧化石墨烯(GO)和二氧化铈(Ce O2)良好的生物化学特性,将AFM1单克隆抗体更好的固定在SPEs上。AFM1免疫传感器的性能通过差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)和循环伏安法(Cyclic voltammetry,CV)进行了研究。在最佳条件下,在0.01~1 ng/m L之间呈现了良好的线性关系,检测限为0.009 ng/m L。该方法特异性好,灵敏度高,利用该免疫传感器对牛奶样品进行了检测,加标回收率在96.15%~104.25%之间。(2)基于二抗标记法的DON时间分辨荧光免疫层析检测技术研究。将DON作为目标分析物,将聚苯乙烯荧光微球作为标记材料,与羊抗鼠Ig G进行偶联制备了基于二抗标记的荧光探针,优化了1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)用量、羊抗鼠Ig G标记量、免疫试剂喷涂量、DON单克隆抗体用量等参数,开发了基于二抗标记法的DON时间分辨荧光免疫层析检测方法。由于单分子的DON单克隆抗体可以结合多个荧光探针,所以基于二抗标记法的检测方法可以放大单位抗体上的荧光信号强度,提高了检测灵敏度。在甲醇溶液、玉米基质、饲料基质中,该方法对DON的检测灵敏度分别为0.121、0.206、0.216 ng/m L。对空白玉米、饲料基质进行加标实验,在玉米基质中的回收率在88.07%~121.22%之间,相对标准偏差低于10.49%;在饲料基质中的回收率在94.8%~107.49%之间,相对标准偏差低于8.74%。将该检测方法与高效液相色谱串联质谱法(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)进行了对比,回收率在80.24%~117.4%之间。该方法检测灵敏度高、精确度和准确度良好、特异性好,节省了单克隆抗体用量,可以在短时间内实现对DON的检测。
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