近年来,随着我国城市化进程的加快,观赏竹不仅被用于城市居民小区的园林绿化上,而且被广泛应用于河边、海边的绿化中,由于全球气候变暖,我国沿海地区缺水严重,河边和海边的土壤盐化和次生盐渍化加剧,不利于观赏竹的生长,甚至造成死亡,给园林绿化造成重大损失。因此,耐盐竹子种质资源的筛选及品种选育尤为重要。迄今,对竹子盐胁迫的生理生化响应机制及分子机制的研究少有报道,本研究以不同浓度NaCl溶液对盆栽观音竹(Bambusadea multiplex var. riviereorum)进行胁迫,测定竹叶的各项生理生化指标,分析各个生理生化指标的变化规律,阐明观音竹盐胁迫的生理生化响应机制；在此基础上,以NaCl溶液胁迫的观音竹的幼叶为试验材料,构建竹叶均一化全长cDNA文库并进行大量测序,对测序获得的ESTs进行同源性分析和功能预测,找出一些与盐胁迫相关的基因,采用实时荧光定量PCR法,检测这些基因的表达动态,以水稻为模式植物,将这些基因转化水稻,获得转基因植物,对这些基因的功能进行初步鉴定,探讨观赏竹应答盐胁迫可能的分子机制,为采用基因工程手段提高观赏竹耐盐性提供有应用价值的基因。具体研究结果如下：1.NaCl胁迫试验,植株材料选择1年生的观音竹苗,NaCl浓度梯度设置为：0、0.1、0.3、0.5和0.8%(质量分数),以不同浓度NaCl胁迫盆栽观音竹,在胁迫第5、9、13、17、21、25 d采样进行生理生化指标的测定,并在胁迫25天后测定植株生长指标。对不同盐浓度及不同胁迫时间下观音竹的生理生化特征和植株生物量的变化进行了研究。结果表明,随着NaCl浓度的提高,观音竹茎叶鲜重、茎叶干重、根系鲜重、根系干重、根冠比显著降低,特别是NaCl浓度大于0.3%后,这些生长指标下降加快,表明观音竹的生长受到高盐的抑制,且根系对盐的敏感程度大于茎叶部分,但从外观来看,叶片没有出现明显的可见伤斑。随着NaCl浓度的提高及胁迫时间的延长,观音竹叶片相对含水量显著降低而水分饱和亏缺显著增加；叶绿素a、叶绿素b及叶绿素(a+b)含量显著降低,但叶绿素a/b比值增加,表明盐胁迫对观音竹叶片水分及光合色素含量造成了不利影响。本研究中,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)活性先增加后减少,充当渗透调节物质的游离脯氨酸与可溶性蛋白质也表现为先增后减的趋势,表明盐胁迫下的观音竹可通过提高抗氧化酶活性和积累渗透调节物质来抵御盐害,但随着胁迫的加剧,它们对细胞的保护作用逐渐减弱。观音竹电导率及丙二醛(MDA)含量的逐渐增加表明了盐胁迫破坏了观音竹细胞膜的完整性,使脂质过氧化和电解质外渗加剧。应用因子分析法对所测定的13个生理生化指标进行分析,得出观音竹耐受盐胁迫的盐浓度与胁迫时间的节点为0.5%NaCl胁迫第13 d,表明观音竹不宜在NaCl浓度大于0.5%(质量分数)的土壤中长期生长,否则其生长受到抑制。2.以0.5% NaCl胁迫盆栽观音竹第12 d的幼叶为材料,应用DSN均一化与SMART建库技术相结合,构建幼叶均一化全长cDNA文库并对文库质量进行鉴定。经检测该原始文库滴度为1.7×106 cfu·mL-1文库重组率达97%,插入片段平均长度为1.5 kb,可以满足后续大规模测序等要求。从原始文库中随机挑取600个克隆子,从5’端单向测序获得574个有效且高质量的ESTs,序列长度最短为403 bp,平均长度为975 bp。用Phrap软件进行拼接共获得543个非重复序列(unigene),其中,30个为片段重叠群(contigs),513个为单基因(singletons),文库冗余率仅为5.4%。运用Blast同已完成基因组测序的水稻、玉米、高梁3个物种的基因库进行库内比对以及WEGO注释,结果显示,324个unigenes(59.7%)相似于已知或推定功能的蛋白,94个(17.3%)相似于未知功能的蛋白,125个(23.0%)没有比对上任何蛋白,推定为新基因。将编码已知或推定功能蛋白的unigenes进一步分类显示,324个unigenes共获得1442个GO terms,这些GO terms归为3类：生物学过程、细胞组件、分子功能。其中生物学过程所占的GO terms最多(539),占37.4%,其次是细胞组件(518)和分子功能(385),分别占35.9%和26.7%。324个unigenes中参与对外界刺激的应答的GO terms有80个,占24.7%。这些ESTs编码的氨基酸序列与过氧化物酶、蛋白激酶、热激蛋白、锌指蛋白、脱水响应相关蛋白、GTP结合蛋白、转录因子等防御反应相关蛋白有较高的同源性。3.在对ESTs分析的基础上,选取具有代表性的8个推定的耐盐相关基因,利用Primer premier 5软件设计荧光定量特异引物,应用实时荧光定量PCR法分析这些基因在盐处理组(经0.5%NaCl溶液胁迫)与对照组中表达量的差异。结果显示：蛋白激酶基因(Ptil)、RNA解旋酶基因(DRH3)、热激蛋白基因(HSP)和脱水应答蛋白基因(DRP)在盐处理8d的表达量受到盐胁迫的诱导；离子转运体基因(AATP)和抗氧化酶基因(Cu/Zn-SOD)的表达量在处理组的4-12 d增加明显,NADPH氧化还原酶基因(NADPH-DO)在处理组与对照组中表达水平差异不明显,而叶绿素a/b结合蛋白基因(CAB)的mRNA受到盐胁迫的负调控,根据基因表达与功能的相关性,推测这些基因(除NADPH-DO外)参与了观音竹对盐胁迫的应答,可能与观音竹的盐适应性相关。4.蛋白激酶在植物的抗盐途径中发挥着非常重要的作用。本研究从观音竹幼叶均一化全长cDNA文库中获得一个类Pti1的蛋白激酶基因,命名为Bmptil(GeneBank:JQ907320)。该基因序列长1283 bp,包含一个1092 bp的完整开放阅读框,编码一个有364个氨基酸的蛋白。利用PlantsP在线分析显示,BmPtil蛋白的第65-346位氨基酸代表一个蛋白激酶催化结构域,其中包含1个酪氨酸(Tyr)蛋白激酶特异活性位点,1个ATP结合区,还显示第68-342位氨基酸之间是一个酪氨酸蛋白激酶。Pti蛋白的氨基酸序列同源比对表明,BmPtil蛋白的氨基酸序列与玉米、水稻、苜蓿、大豆等植物的Pti具有很高的同源性,同样具有蛋白激酶催化结构域的11个亚结构域,存在一个Pto-Ptil结合所必需的保守的Thr残基,推测BmPtil基因可能编码一个有功能的Ser/Thr/Tyr蛋白激酶,通过与其它Pti蛋白类似的机制来参与信号传导途径,行使相似的功能。BmPtil基因启动子的克隆与序列分析表明Bmptil基因的表达可能受到水杨酸(SA)、赤霉素、低温、干旱及脱落酸(ABA)等条件的调控。荧光定量分析显示该基因的表达受到盐胁迫条件的强烈诱导,本研究以水稻为模式植物,将Bmptil基因转化水稻,获得T0代转基因植株,经PCR检测,阳性率达100%,RT-PCR检测扩增出清晰的单条带,证明Bmptil基因已整合入水稻的基因组中,并能在转录水平实现表达。对这些To代转基因植株应用250 mmol·L-1 NaCl溶液胁迫进行转基因植株抗盐性评价,结果表明,与对照相比,T0代转基因株系在表型上有更少的盐害症状,生理上具有更高的SOD活性与叶绿素含量,初步判断转Bmptil基因提高了植物的耐盐性。