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昆虫的嗅觉感受主要通过覆盖于触角表面的大量嗅觉感器来完成。气味分子通过感器表面的孔进入感觉淋巴液,在感器内与气味结合蛋白和气味受体相互作用后,将信号传递到中枢神经系统,使昆虫做出相应的行为反应。气味分子与受体相互作用后,须在短时间内变为失活状态,使信号终止,恢复感器的敏感性,才能保障受体神经对随后的气味刺激做出及时和准确的反应。目前认为,气味分子的失活主要由气味降解酶来完成。细胞色素P450(Cytochrome P450s,简称为CYPs或P450s)是一类重要的气味降解酶,在昆虫的嗅觉行为中发挥重要作用。飞蝗作为世界上重要的农业害虫,对农作物尤其对小麦,玉米及高粱等禾本科作物为害极大,给农业生产造成严重的经济损失。在复杂的自然环境中,飞蝗能够不断地接受外界信息,气味降解酶发挥着不可或缺的作用。本文通过转录组、RT-qPCR等方法系统地研究了飞蝗触角P450的特性,并采用RNA干扰方法结合触角电位和行为测定,研究了触角P450在飞蝗嗅觉行为中的生理功能。研究结果如下:一、飞蝗触角转录组的构建及分析本文构建了飞蝗触角转录组数据库,共获得11.07 Gb碱基序列,15,3792个转录本。经组装后获得75,444个unigenes,平均长度为947 bp。将unigenes在Nr、Nt、GO、COG和KEGG等数据库中进行功能注释,总注释量达41.12%。飞蝗触角转录组数据库的构建及分析,为后续P450基因的克隆、特性分析及功能研究提供了重要信息。二、飞蝗触角P450基因的搜索及筛选从飞蝗触角转录组数据库中共搜索到92个P450基因,经序列拼接后,共得到68个P450全长基因和24个基因片段。对68个全长P450基因进行了系统发育分析,结果表明,大部分P450聚于CYP3簇和CYP4簇,推测这些P450可能参与外源物质的代谢。通过RT-PCR对68个全长P450基因在不同组织部位的分布进行研究,初步筛选出46个在触角组织中有表达的基因。进一步通过RT-qPCR对上述基因在更多组织部位的表达进行了测定,共得到4个在触角特异表达的基因,分别为:CYP4C99、CYP6FD5、CYP6NY1和CYP3327A1,8个在触角高表达的基因,分别为:CYP6MU1、CYP305M1、CYP3117C1、CYP3117D1、CYP3117E1、CYP3117F2、CYP3114A1和CYP3372A1,初步推测这些P450基因可能参与气味物质的降解,在飞蝗的嗅觉行为中发挥功能。三、飞蝗CYP6FD5和CYP6MU1基因的分子特性分析本章选取CYP6FD5和CYP6MU1基因进行分子特性研究。通过RT-PCR方法对这两个基因的全长序列进行了验证,并把基因序列提交至Genebank,获得登录号:KY852428和KY852414。生物信息学分析显示两个氨基酸序列均具有P450共有的5个保守序列。聚类分析显示,这两个P450与黑腹果蝇P450的CYP6a家族亲缘关系最近。不同组织部位的表达谱显示,这两个基因均在触角高表达,其中CYP6FD5在触角特异表达,CYP6MU1在触角表达量最高,其次为下颚须和跗足。在飞蝗不同发育阶段的表达谱显示,这两个基因在整个发育阶段都有表达。上述结果为后续功能的研究提供了基础条件。四、飞蝗CYP6FD5和CYP6MU1在触角中的功能研究将两个基因的dsRNA注射入飞蝗触角窝内24 h和48 h后,这两个基因均能被有效地沉默。通过RNA干扰结合触角电位和行为反应,测定了4龄飞蝗对禾本科植物挥发物和蝗虫挥发物的电生理及行为反应。结果显示,沉默CYP6FD5基因后,飞蝗雌虫对顺-3-乙酸己烯酯、反式-2-己烯醛和癸醛的触角电位降低,雄虫对顺-3-乙酸己烯酯、反式-2-己烯醛、癸醛、4-乙烯基苯乙醚、苯乙腈和苯甲醛的触角电位降低。沉默CYP6MU1基因后,飞蝗雌虫对壬醛、愈创木酚和4-乙烯基苯乙醚的触角电位降低,雄虫对反式-2-己烯醛、苯甲醛、4-乙烯基苯乙醚和癸醛的触角电位降低。沉默这两个基因后,飞蝗对小麦苗的行为反应无显著变化。结果表明,CYP6FD5和CYP6MU1在飞蝗触角的嗅觉行为中发挥功能。综上所述,本文通过构建飞蝗触角转录组数据库及RT-qPCR方法在飞蝗触角中筛选出4个特异性和8个高表达的P450基因。通过RNA干扰结合触角电位和行为反应,研究了触角特异表达的CYP6FD5基因和触角高表达的CYP6MU1基因在飞蝗嗅觉行为中的功能。研究结果为进一步深入研究触角P450在飞蝗嗅觉行为中的功能及降解机理奠定了基础,为基于行为反应的蝗虫绿色防控技术提供了理论依据。