水葫芦(Eichhornia crassipes Solms)是我国普遍发生和危害严重的外来入侵植物之一,目前水葫芦的防除主要依靠化学农药,但随着环保意识的加强,水葫芦的生物防治受到人们的日益重视。为探讨利用病原菌对水葫芦进行生物防除,在重庆部分地区进行水葫芦病害调查和采样,以发现对该杂草具有控制作用的病害并分离得到具有强致病性的菌株。通过调查,记录到田间自然发生的水葫芦褐斑病和叶斑病两种新病害。本研究对这两种病害进行了诊断,鉴定了导致病害的病原菌,并研究了两种病原菌的主要培养特性。一、水葫芦褐斑病病害诊断.水葫芦褐斑病在自然条件下发病叶片多有长条形、梭形或椭圆形褐色病斑,可引起该杂草的黄枯萎蔫甚至整株死亡。采集具有典型病斑的水葫芦叶片,通过组织分离和纯化得到5个菌株,并通过柯赫氏法则病律证明菌株WH010为水葫芦褐斑病的病原菌。病原菌鉴定.该菌在PDA培养基上长势良好,菌落圆形、白色,产黄色色素,有轮纹；培养15d菌落表面长出黑色油圆球状或不规则状、具光泽而湿润的分生孢子堆；镜检分生孢子纺锤形或倒棍棒状,大小为14.2-28.5×4.1-7.8μm,直或稍微弯曲,5个细胞,各细胞之间分隔均为真隔膜,两端细胞壁薄,无色,中间3个细胞呈橄榄褐色,色泽一致；顶端附属丝2-3条。对病组织进行切片可见分生孢子盘杯状,散生或集生,初埋生后外露,黑色或暗褐色底层由厚壁、角状、暗褐色细胞构成,盘表面产孢区细胞壁薄,色淡。依据病原菌的形态特征、rDNA ITS区段(GenBank登录号为JF502635)及β-tubulin区段(GenBank登录号为JQ694097)分子鉴定结果,该病原菌的无性时期鉴定为石楠拟盘多毛孢(Pestalotiopsis photinia)。菌株WH010的主要特性.该菌培养及产孢最佳培养基是PDA,最适温度为25℃,孢子萌发最适温度为25-28℃；菌丝生长适宜酸碱度范围是pH5.0-9.0,最适约为pH6.0,产孢适宜酸碱度范围是pH5.0-10.0,最适约为pH6.0：光照有利于菌丝生长和产孢,但抑制分生孢子萌发；对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖三种碳源及牛肉膏、蛋白胨两种氮源利用效果最好。该菌PD液体培养基静止培养10d后获得粗提液,采用离体叶片浸渍法与针刺法检测粗提液的活性所得结论基本相同,即粗提液具有致毒活性,且两种处理下叶片均表现褪绿症状。将粗提液用乙酸乙酯萃取提取,再将得到的油相进行色谱柱层析纯化。对分离后的合并瓶进行生物测定,各合并瓶均无致毒活性,因此本研究未探索出菌株WH010的毒素纯化条件。二、水葫芦叶斑病病害诊断.自然条件下水葫芦叶斑病发病初期叶片上产生水渍状不规则形或椭圆形墨黑色病斑,并伴有黄色晕圈。随病情发展病斑多沿叶脉向两旁叶肉浸润状发展。发病后期天气干燥时整个植株发黄萎蔫死亡,多雨潮湿时叶片局部或全部腐烂,但无臭味。采集具有典型病斑的水葫芦叶片,通过组织分离和纯化得到10个菌株,并通过柯赫氏法则病律证明菌株WA10A为水葫芦叶斑病的病原菌。病原菌鉴定.该菌在PDA培养基上的菌落呈规则圆形；菌丝初为白色,后变为杏黄色,产生褐色色素；培养8d菌落表面产生大量暗棕色小点,培养10d后产生红色、球形子囊壳；子囊壳亚球形或卵形,表面粗糙,散生在培养基的表面,直径300-400μm；子囊壳在3%KOH水溶液中深红色,在乳酸中为黄色；挑取子囊壳制成玻片,轻轻压破镜检,有大量的子囊喷出；子囊呈棒状,透明,大小为80-120×9-14μm。子囊孢子纺锤型至镰刀型,略弯曲,两端稍圆,通常有1-3个隔膜,平均大小为38.5-49.5×4.1-5.8μm。分隔处常有缢缩。依据病原菌的形态特征、rDNAITS区段(GenBank登录号为JQ694094)及β-tubulin区段(GenBank登录号为JQ694096)分子鉴定结果,该病原菌的有性时期鉴定为冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicicola)。菌株WA10A主要特性.该菌培养及产孢最佳培养基是PSA；最适温度为28℃,产孢最适温度为25-28℃,孢子萌发最适温度为28℃；茵丝生长和产孢适宜酸碱度范围是pH5.0-9.0,最适约为pH6.0；光照有利于菌丝生长和产孢,但抑制子囊孢子萌发；对葡萄糖、可溶性淀粉两种碳源及牛肉膏、蛋白胨两种氮源利用效果最好。该菌PS液体培养基振荡培养7d获得粗提液,离体叶片浸渍法与针刺法两种处理检测粗提液的活性均表现很强的致毒活性,且两种处理下叶片均表现黄化褪绿。将提取液用乙酸乙酯萃取提取,再将获得的萃取物进行色谱柱层析纯化,得到合并瓶8个,通过生物测定得出合并瓶3、6、7含有对水葫芦叶片有致毒作用的活性物质。说明通过色谱柱层析纯化后,毒素得到了很好的分离,也可推测菌株WA10A可能不止产生一种毒素。两种病原菌的寄主范围测定.用病原菌菌丝、孢子悬浮液处理8个科的21种植物种子和盆载植株,我们得知菌株WH010对供试植物种子萌发率和植株生长无没有明显影响和危害。而菌株WA10A对黄瓜、冬瓜植株叶片有较弱致病力,对供试的其它植物没有致病力,对所有供试植物的种子萌发率无明显影响。同时,用两种病原菌的粗提液处理供试植物种子和盆栽植株均为表现出致病力。经调查发现水葫芦褐斑病和叶斑病发生普遍而严重,在田间对水葫芦无疑具有一定的自然抑制作用。两种病害的病原菌分别被鉴定为石楠拟盘多毛孢(P. photinia)和冬青丽赤壳菌(C.ilicicola)。拟盘多毛孢和丽赤壳的主要培养特性测定结果表明,它们对温度和酸碱度的适宜范围较广,适应能力和存活能力较强,其培养粗提液对水葫芦有较强的致病活性。拟盘多毛孢及其粗提液只对水葫芦有致病作用,而对其它21种供试植物均不致病。丽赤壳仅对黄瓜、冬瓜植株叶片有较弱致病力,而对其它供试植物不致病。由此可见,两种病原菌在水葫芦的生物控制中可能具有重要的应用潜力,值得进一步研究。