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研究目的:肿瘤的免疫抑制微环境(TIME)是影响嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗效(尤其是实体肿瘤)的主要问题之一[1]。程序性死亡-1(PD-1;CD279)是一种位于细胞表面的I型跨膜受体,同时也是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞甚至活化的血管内皮细胞上表达最广泛的T细胞抑制受体[2]。PD-1通路在所有免疫抑制信号通路上似乎是一个“主开关”,因为在某些情况下,单一剂量的抗PD治疗可以使得肿瘤微环境从最初的高度抑制状态变为高度活跃的炎症部位[3]。许多癌症类型过度表达PD-L1,通过PD-1/PD-L1/2相互作用损害T细胞的抗肿瘤反应以逃避免疫系统的攻击[4]。但是PD1-PDL1通路对于维持正常的外周免疫耐受也非常重要,如果直接靶向PDL1可能会引起非常严重的脱靶效应。如何通过CAR的结构改造使得CAR T细胞以调节CAR对于不同靶点的亲和力,使得CAR T细胞既可以避免PD1的免疫抑制信号,又不至于产生脱靶是一个非常有价值的研究的课题。研究内容和方法:我们将PD1的部分片段插入到针对CD19的二代CAR的结构中,制备靶向CD19和PDL1的新型的双亲和力CAR,分别命名为PD1-BAT1,2,3。第一,我们用慢病毒转染T细胞制备了可稳定表达于T细胞表面的CAR T细胞;第二,我们对新型双特异性CAR T细胞的杀伤功能,细胞因子分泌,体外培养增殖,特异性增殖进行了检测;第三,我们还在NALM-6-PDL1负瘤的NSG小鼠模型上对于新型双特异性CAR T的安全性和有效性进行了进一步验证;第四,为了探索不同的CAR T细胞不同功能的原因我们进一步对CAR T细胞和肿瘤细胞孵育后,CAR T细胞的转录组学和代谢进行分析;最后我们针对不同结构的CAR T细胞所产生的不同生物学效应和其结构之间的关系进行了机制探索。研究结果:1.用流式检测双亲和力的CAR都能稳定的表达于T细胞的表面,但是PD1-BAT2的表达效率要低于其他结构的CAR的表达效率;2.PD1-BAT1,2增强了其对于CD19~+PDL1~+的细胞的生物学效应,但是PD1-BAT1表现出针对CD19~-PDL1~+的脱靶性杀伤;3.PD1-BAT2/3相比经典的二代CAR T细胞都表现除了抗原特异性的细胞因子分泌量减少;4.PD1-BAT2/3在NALM-6-PDL1负瘤的NSG小鼠模型中都表现出了抗肿瘤活性的增强并且延长了小鼠的生存曲线,但是PD1-BAT1细胞表现除了对NSG小鼠严重的脱靶效应——辐射样脱毛的不良反应和中枢神经系统受侵犯的偏头症状。5.PD1-BAT2/3在杀伤肿瘤的过程中表现出更“干性”的分化,更少的耗竭性T细胞表型;6.和经典的二代CAR T细胞相比,PD1-BAT3细胞在和NALM6-PDL1孵育之后其线粒体的耗氧率更高。7.相比较针对CD19靶点的经典二代CAR T细胞,PD1-BAT2/3降低了其对于CD19蛋白的亲和力。研究结论:我们在针对CD19靶点的经典的二代CAR T细胞结构的基础上构建出了可逆转PD1免疫抑制信号的二代CAR T细胞。其对于表达CD19和PDL1的肿瘤具有更好的抗肿瘤生物学效应且并不对只表达PDL1的细胞产生杀伤效应。有趣的是新型的双靶点CAR T细胞不仅能逆转PD1的免疫抑制效应同时在杀伤肿瘤的过程中还能分泌更少的细胞因子,因此新型的双亲和力CAR T细胞有可能会避免在CAR T的临床使用中所诱发的CRS。新型的双靶点CAR T细胞对于肿瘤的治疗可能提供一种更加有效且安全的方案。