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目的探讨siRNA干扰CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法利用RT-PCR检测CLIC1基因在胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803中的表达；化学合成四对CLIC1siRNA,分别标记为CLIC1siRNA1、CLIC1siRNA2、CLIC1siRNA3和CLIC1siRNA4,利用脂质体Lipofectamine2000瞬时转染胃癌细胞SGC-7901和MGC-803。采用标记有荧光的阴性对照siRNA在荧光显微镜下检测转染效率；转染24h、48h、72h后,通过实时定量PCR和Western blot分别检测CLIC1mRNA和蛋白的表达,筛选出干扰效果最好的siRNA片段；用抑制率最高的siRNA及无义阴性对照再次转染胃癌细胞SGC-7901和MGC-803,设立脂质体对照和空白对照。MTT法检测CLIC1抑制前后细胞增殖情况；转染48h后收集细胞,分别进行AnnexinV-FITC和PI双染,观察细胞各组凋亡变化情况；P工单染,观察各组细胞周期变化情况；转染48h后应用Transwell小室及Matrigel胶,通过计数细胞数目分析细胞侵袭迁移能力的变化。结果1.胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803均存在CLIC1基因的表达。2.按照脂质体说明书推荐的比例转染胃癌细胞,转染效率约为80%。3.用实时荧光定量PCR法和Western blot方法分别检测转染24h、48h、72h后CLIC1基因mRNA和蛋白的表达情况。结果显示,转染24h、48h、72h后SGC-7901细胞CLIC1基因mRNA相对表达量在CLIC1siRNA片段转染组中与各对照组中比较差异显著(P<0.05)。在MGGC-803中,转染24h后,只有CLIC1siRNA1、CLIC1siRNA3、CLIC1siRNA4组跟各对照组比较差异显著(P<0.05),siRNA2组跟各对照组比较无明显差异(P>0.05)；转染48h、72h后CLIC1siRNA组基因mRNA跟各对照组比较有显著差异(P<0.05)。两株细胞各个时间点中,空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组之间比较差异均不显著(P>0.05)。四个片段中CLIC1siRNA3的抑制作用最好,转染24h、48h、72h后的抑制率在SGC-7901中分别为98.35%、94.15%、95.38%。而在MGC-803中分别为78.33%、86.81%、84.65%。蛋白表达水平的检测结果显示,SGC-7901细胞中,转染24h后只有CLIC1siRNA3、CLIC1siRNA4组跟各对照组比较差异显著(P<0.05),CLIC1siRNAK CLIC1 siRNA2组跟各对照组比较无明显差异(P>0.05)；转染48h、72h后CLIC1siRNA组与各对照组比较,CLIC1蛋白表达则显著下调(P<0.05)。不同片段之间比较,24h、48h、72h时CLIC1siRNA3抑制率最高,分别达到70.00%、76.39%和87.90%,通过对不同时间点抑制率的观察发现,CLIC1siRNA4在24h的抑制效果最好为55.51%,而CLIC1siRNA1、CLIC1siRNA2和CLIC1siRNA3组则在72h时抑制效果最好,分别为46.29%、50.39%和87.90%。在MGC-803细胞中,转染48h后,只有CLIC1siRNA1、CLIC1siRNA3和CLIC1siRNA4组与各对照组细胞比较,CLIC1蛋白的表达显著下调(P<0.05),而CLIC1siRNA2组与各对照组之间比较无明显差异性(P>0.05)。转染24h、72h后,CLIC1siRNA组与各对照组细胞比较,CLIC1蛋白的表达则显著下调(P<0.05)。其中CLIC1siRNA1、CLIC1siRNA2, CLIC1siRNA4在24h的抑制作用最好,分别达到85.57%、51.09%和88.57%。CLIC1siRNA3则在48h的抑制率最好为81.97%。在两株细胞三个时间点中,空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无显著差异(P>0.05)。转染CLIC1siRNA后可有效下调胃癌细胞CLIC1蛋白的表达。结果显示,CLIC1siRNA可特异性、高效地下调CLIC1基因的表达；不同的CLIC1siRNA片段对CLIC1基因表达的抑制作用不同；而相同的片段在不同时间点对CLIC1基因表达的抑制作用也不同,总体上CLIC1siRNA对mRNA和蛋白的抑制率在48h最好。从抑制率跟稳定性来看,CLIC1siRNA3片段的效果最好。我们选择CLIC1siRNA3开展后面的实验。5.MTT检测结果：用CLIC1siRNA3转染胃癌细胞SGC-7901和MGC-803。两株细胞转染24h、48h和72h后转染组与空白对照组、脂质体对照组相比较差异均显著(P<0.05)。空白对照组、脂质体对照组之间比较均无明显差异性(P>0.05)。抑制CLIC1表达后,胃癌细胞增殖能力明显增强。SGC-7901中各时间点的增殖率分别为25.60%、23.30%、21.52%；MGC-803中的增殖率分别为15.22%、38.11%、21.43%。6.转染48h后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803凋亡情况：空白对照组、脂质体对照组、CLIC1siRNA3组中细胞凋亡率在SGC-7901为23.92%±2.47%、25.56%±3.37%、9.03%±1.20%；在MGC-803为19.59%±3.31%、20.52%±2.88%、9.27%±2.19%。转染组的凋亡细胞明显减少,与各对照组比较差异显著(P<0.05)。空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组之间比较均无显著差异性(P>0.05)。7.转染48h后细胞周期分布：空白对照组、脂质体对照组、CLIC1siRNA3组G2/M期细胞比例在SGC-7901分别为6.03%±0.70%、6.84%±0.84%、22.08%±2.41%,在MGC-803分别为8.39%±1.69%、9.16%±1.26%、19.14%±2.18%。siRNA3组G2/M期细胞明显增多(P<0.05),同时,G0/G1期、S期比例相应的减少。空白对照组、脂质体对照组之间比较无明显差异性(P>0.05)。8.侵袭实验显示,转染48h后,空白对照组、脂质体对照组和CLIC1siRNA3组侵袭细胞个数在SGC-7901中分别为65.67±6.03、67.67±3.51、30.00±5.00,在MGC-803细胞中分别为63.00±2.65、64.33±4.51、37.33±4.93。CLIC1siRNA3组与各对照组比较有显著差异(P<0.05)。空白对照组、脂质体对照组之间比较均无显著差异(P>0.05)。抑制CLIC1表达后对SGC-7901细胞侵袭能力的抑制率为54.31%,对MGC-803细胞侵袭能力的抑制率为40.74%。9.迁移实验显示,转染48h后,空白对照组、脂质体对照组和CLIC1siRNA3组迁移细胞个数在SGC-7901分别为78.33±5.51、76.00±4.58、52.00±5.29,在MGC-803细胞中分别为76.33±7.02、76.00±3.61、54.00±4.58。CLIC1siRNA3组与各对照组比较差异显著(P<0.05)。空白对照组、脂质体对照组之间比较均无显著差异(P>0.05)。抑制CLIC1表达后对SGC-7901细胞迁移能力的抑制率为33.62%,对MGC-803细胞迁移能力的抑制率为29.26%。结论1.胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803中存在CLIC1基因的表达,可以用于siRNA抑制CLIC1基因的表达,进行CLIC1基因在胃癌细胞生物学行为中的作用的研究。2.脂质体介导的CLIC1siRNA转染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,可特异性、高效地下调CLIC1基因的表达。不同的CLIC1siRNA片段对CLIC1基因表达的抑制作用不同；而相同的片段在不同时间点对CLIC1基因表达的抑制作用也不同。总体上讲,siRNA对CLIC1的表达抑制作用48h最强。说明,RNAi是一种抑制胃癌细胞CLIC1基因表达的有效的方法。3.抑制CLIC1表达,导致体外培养的胃癌细胞的增殖明显增强、凋亡减少、细胞周期阻滞在G2/M期。4.抑制CLIC1表达,胃癌细胞侵袭迁移能力受抑。表明,通过RNAi抑制CLIC1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的法。为完善胃癌的治疗方法、改善胃癌患者的预后,提供了新的思路。