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研究背景巨噬细胞是免疫细胞的一种,广泛存在于人体多个器官、组织,在机体的发育、稳态、组织修复和免疫过程中发挥重要作用。巨噬细胞具有高度可塑性,在微环境的刺激下,其基因表达谱、形态、代谢和功能会发生改变,以适应机体的需求,这种现象称为巨噬细胞的极化。巨噬细胞极化谱中的两种极端类型,分别被称为经典激活巨噬细胞(Classically activated macrophages,Ms or M1)和替代性激活巨噬细胞(alternatively activated macrophages,Ms or M2)。LPS 和IFN-gamma可以诱导巨噬细胞在极化谱上向M1方向移动,而IL-4可以诱导巨噬细胞向M2方向移动。巨噬细胞极化状态的改变,与肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤等多种疾病的发生密切相关。巨噬细胞在胚胎植入过程中可能起到关键作用。研究发现,体外培养的滋养层细胞可通过分泌促炎因子和趋化因子促进巨噬细胞的迁移和增殖。白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,IF)敲除可导致小鼠胚胎植入障碍,同时其子宫内膜巨噬细胞数量也减少。在胚胎植入早期,植入位点附近巨噬细胞比例明显增加,提示其可能参与植入的调控。胚胎植入是受孕后,胚胎黏附、侵袭并定植入子宫内膜的过程。对人类而言,每个月经周期的植入成功率仅有约30%,约75%的受孕失败是由植入失败引起的。故而胚胎植入是正常妊娠最为关键的首要环节。二硫化碳(Carbon Disulfide,CS2)是一种无色易挥发的有机溶剂,在硫化橡胶、熏蒸粮食、制造粘性人造纤维等多种工业生产中被经常使用。尽管其具有多系统毒性,CS2仍然在很多发展中国家生产和使用。既往研究发现,CS2具有生殖毒性。CS2暴露女工可发生月经失调和生殖障碍,例如胚胎吸收和流产。本课题组前期的流行病学研究发现,CS2暴露可导致女工受孕所需时间延长,CS2暴露女工的早早孕胚胎丢失率明显增高。这些现象说明CS2暴露可通过干扰胚胎植入导致胚胎丢失。研究目的本研究对体外培养和体内原位的巨噬细胞进行CS2处理,检测巨噬细胞极化相关分子mRNA和蛋白质表达水平变化,检测体外培养巨噬细胞M1/M2比例以及血管生成相关分子NO和VEGF生成量变化,检测CS2暴露后小鼠子宫内膜植入位点附近血管生成情况和M1/M2比例,以探究子宫内膜巨噬细胞极化在CS2致小鼠胚胎植入障碍过程中的可能作用,进一步揭示胚胎植入障碍的机制。研究方法1.实验设计本研究包含三部分研究内容。第一部分为巨噬细胞体外暴露,小鼠腹腔巨噬细胞经诱导增殖后在体外培养时进行CS2染毒。第二部分为巨噬细胞体内暴露,动情期小鼠腹腔巨噬细胞经诱导增殖后不同时间点进行CS2染毒。第三部分为孕鼠植入前期暴露观察植入期子宫巨噬细胞极化和血管新生情况。2.动物模型本研究以性成熟雌性KM小鼠作为研究对象,在巨噬细胞体外暴露实验中,腹腔注射4%巯基乙酸盐(thioglycollate,TG)诱导巨噬细胞增殖,获取并体外培养巨噬细胞,培养液中添加CS2染毒。在巨噬细胞体内暴露实验中,选取处于动情期的雌性小鼠,腹腔注射4%巯基乙酸盐(thioglycollate,TG)诱导巨噬细胞增殖,并在其后不同时间点腹腔注射CS2染毒。在孕鼠植入前期暴露观察植入期子宫巨噬细胞极化和血管新生情况实验中,雌鼠与雄鼠合笼后,次日早上阴栓阳性者记为孕第0.5天(GD0.5)。在GD1.5实验组给予腹腔注射CS2染毒,在孕GD3.5、GD4.5、GD5.5天取小鼠子宫,对内膜进行免疫组化染色。3.实验方法对于体内原位和体外培养的巨噬细胞,进行CS2染毒,用聚合酶链式反应法(Real-time Quantitative Polymerase Chin Reaction,qPCR)检测巨噬细胞极化标志性分子的mRNA表达水平,用免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测巨噬细胞极化标志性分子的蛋白表达水平。用流式细胞术检测体外培养巨噬细胞Ml和M2两种极化类型的比例。用试剂盒检测体外培养巨噬细胞NO合成量,用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测体外培养巨噬细胞VEGF合成量。最后,用免疫组织化学法检测CS2染毒围植入期小鼠子宫内膜血管新生情况,以及M1/M2型巨噬细胞比例。研究结果1.CS2对巨噬细胞极化相关因子mRNA和蛋白质表达水平的影响对体外培养的巨噬细胞,在大多数实验组,CS2处理可以抑制Ml型巨噬细胞极化相关分子标志物NOS2和IL-6的mRNA表达,以及NOS2的蛋白质表达;促进M2型巨噬细胞极化相关分子标志物ARG1和CHIL3的mRNA表达,以及ARG1的蛋白质表达。对体内原位的巨噬细胞,以上现象均相同。2.CS2对巨噬细胞M1和M2极化类型比例的影响与对照组相比,较低浓度和较高浓度的CS2处理巨噬细胞,均可使M2型巨噬细胞的比例明显上升,M1型巨噬细胞的比例有一定幅度的下降。3.CS2对巨噬细胞合成NO和VEGF的影响不同浓度,不同作用时间的CS2处理,均可抑制体外培养巨噬细胞合成NO和VEGF。CS2作用时间为12h时,CS2的浓度与NO合成量呈现剂量-依赖关系,即CS2的浓度越高,NO合成量越少。4.CS2对围植入期小鼠子宫内膜毛细血管新生和巨噬细胞极化的影响CS2染毒后,在围植入期的三个时间点 染毒小鼠子宫内膜中vWF阳性细胞和NOS2阳性细胞的数量和密度均明显下降,ARG1阳性细胞的数量和密度均明显增加。说明CS2染毒促进了围植入期小鼠子宫内膜巨噬细胞的M2型极化,抑制了M1型极化,同时抑制了子宫内膜血管新生。5.雌鼠腹腔巨噬细胞极化和动情周期的关系动情间期小鼠,巨噬细胞极化相关因子NOS2、ARGl、CHIL3、IL-6的mRNA表达的个体差异较小,但其余3个阶段小鼠个体差异极大。与动情间期小鼠相比,动情前期小鼠IL-6和TNF的mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。提示动情周期会影响小鼠腹腔巨噬细胞的极化平衡。结论1.CS2可以影响巨噬细胞极化平衡,促进M2型极化,抑制M1型极化。通过极化平衡的移动,降低巨噬细胞的促血管新生能力,抑制了围植入期小鼠子宫内膜血管新生,可能是胚胎植入障碍的重要机制之一。2.雌鼠巨噬细胞极化平衡受动情周期的干扰。