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目的:观察新生大鼠卵巢镉暴露后卵母细胞的凋亡及其相关基因表达的变化,研究新生大鼠镉暴露致卵母细胞凋亡及其可能的分子机制,进一步探讨SCF在此过程中的作用及其信号通路研究。方法:4日龄雌性SD大鼠,卵巢体外培养,37℃,5%CO2,培养4天。1.染镉剂量分别为0μM、0.5μM、5μM、10μM、50μM,染镉结束后,通过电透射镜及TUNEL法检测镉致卵母细胞凋亡的改变,采用real time-PCR法及Western-blot法检测卵巢组织中基因Bax、Bcl-2、Bcl-xl、Scf、c-kit的m RNA及蛋白表达水平。2.外源性SCF的干预实验:(1)单独加入SCF,设control、100ng/m L SCF组;(2)染Cd及SCF的变化,设control、10μM Cd、10μM Cd+100ng/m L SCF 3个处理组;(3)染Cd、SCF及ACK-2的变化,设3个处理组,分别为control、10μM Cd+100ng/m L SCF、10μM Cd+100ng/m L SCF+2μg/m L ACK-2;(4)染Cd及SCF、LY294002的变化,设3个处理组,分别为control、10μM Cd+100ng/m LSCF、10μMCd+100ng/m LSCF+10μM LY294002。培养结束后,通过透射电镜及TUNEL法检测卵母细胞凋亡的改变,采用real time-PCR法及Western-blot法分别检测卵巢组织中基因Bax、Bcl-2、Bcl-xl的m RNA及蛋白表达水平。结果:1.新生大鼠卵巢镉暴露对卵母细胞凋亡及相关基因表达的影响(1)透射电镜观察显示:对照组卵母细胞结构清楚,核清晰,核内可见染色质均匀分布,未见异染色质,线粒体、粗面内质网等细胞器丰富。0.5μM Cd染毒组可见少量的异染色质,余观察情况与对照组类似。但余染毒组可见卵母细胞核皱缩,异染色质增多,成块状且边集,可见凋亡小体,线粒体出现空泡、肿胀,各剂量组尚可见大片的脂肪变性。50μM Cd染毒组可见组织结构松散,细胞及细胞器肿胀、溶解,未见完整的细胞。(2)TUNEL法检测卵母细胞凋亡率:除50μM Cd染毒组外,余染毒组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)与对照组比较,除0.5μM Cd染毒组外,余各染毒组Bax m RNA及其蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.01)。(4)与对照组比较,各染毒组Bcl-2 m RNA表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);除0.5μM Cd染毒组外,其余各染毒组的BCL-2蛋白表达下调,差异均有统计学意义(P<0.01)。(5)与对照组比较,各染毒组Bcl-xl m RNA表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。各染毒组BCL-XL蛋白表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.01)。2.新生大鼠卵巢镉暴露对Scf及c-kit的m RNA及蛋白表达水平的影响(1)与对照组比较,各染毒组Scf的m RNA及其蛋白表达差异都有统计学意义(P<0.01);除0.5μM Cd染毒组表达上调,余各染毒组表达下调。(2)与对照组比较,除0.5μM Cd染毒组,各染毒组c-kit的m RNA表达下调,差异都有统计学意义(P<0.01);各染毒组c-kit的蛋白表达差异都有统计学意义(P<0.01);除0.5μM Cd染毒组表达上调,余各染毒组表达下调。3.不同干预组对新生大鼠卵巢卵母细胞凋亡及其相关基因表达的影响(1)外源性SCF对新生大鼠卵巢卵母细胞凋亡及其相关基因表达的影响1)透射电镜观察卵母细胞超微结构显示:SCF组卵母细胞核明显,核仁清楚,细胞核中染色质分布均匀,未见异常染色质,胞质中可见较多的线粒体、内质网等细胞器。2)TUNEL法检测卵母细胞凋亡率:SCF组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。3)与对照组相比,SCF组Bax m RNA表达下调,Bcl-2、Bcl-xl的m RNA表达上调,且差异均有统计学意义(P<0.01)。4)与对照组比较,SCF组BAX蛋白表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05);BCL-2蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)染Cd及SCF对新生大鼠镉暴露致卵母细胞凋亡及相关基因表达的影响1)透射电镜观察卵母细胞的超微结构:SCF+Cd组卵母细胞核明显,常染色质分布均匀,胞质中可见丰富的线粒体、粗面内质网等细胞器。2)与Cd组比较,卵母细胞凋亡率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。3)与Cd组比较,SCF+Cd组Bax m RNA表达下调,Bcl-2、Bcl-xl m RNA表达上调,差异均有统计学意义(P<0.01)。4)与Cd组比较,SCF+Cd组BAX蛋白表达下调,BCL-2蛋白表达上调,且差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,SCF+Cd组BCL-XL蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)染Cd、SCF及ACK-2对新生大鼠卵巢卵母细胞凋亡及其相关基因表达的影响1)透射电镜观察卵母细胞凋亡超微结构:SCF+Cd+ACK-2组中卵母细胞可见空泡改变,凋亡小体及脂肪变性,线粒体少,且结构不完整。2)TUNEL法检测卵母细胞凋亡率:SCF+Cd+ACK-2组与SCF+Cd组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。3)与SCF+Cd组比较,SCF+Cd+ACK-2组Bax m RNA表达上调,Bcl-2、Bcl-xl m RNA表达下调,且其差异均有统计学意义(P<0.01)。4)与SCF+Cd组相比,SCF+Cd+ACK-2组BAX蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.01);BCL-2蛋白表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.染Cd、SCF及LY294002对新生大鼠卵巢卵母细胞凋亡及相关基因表达的影响(1)透射电镜下观察可见LY294002组卵母细胞结构不清楚,核膜皱缩,可见异常的染色质,而线粒体等细胞器较少。(2)TUNEL法检测卵母细胞的凋亡率,SCF+Cd+LY294002组与SCF+Cd组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。(3)与SCF+Cd组相比,SCF+Cd+LY294002组Bax m RNA表达上调,差异具有统计学意义(P<0.01),Bc-xl m RNA表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)与SCF+Cd组相比,SCF+Cd+LY294002组BAX蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.01);p-Akt蛋白表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:根据以上结果,可得出以下结论:1.新生大鼠卵巢镉暴露可引起卵母细胞的凋亡,诱导卵巢中Bax表达上调,Bcl-2、Bcl-xl表达下调是其可能的分子机制之一。2.新生大鼠卵巢暴露镉(5-50μM)可抑制Scf及c-kit表达。3.外源性SCF可通过下调Bax表达及上调Bcl-2、Bcl-xl表达抑制新生大鼠卵巢镉暴露致卵母细胞的凋亡。4.SCF/c-kit-PI3K/AKt通路可能参与新生大鼠卵巢镉暴露致卵母细胞的凋亡过程。