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研究背景与目的
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上最常见的癌症之一，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。据报道，2015年我国结直肠癌新增病例约为376，300例，死亡病例约为 191，000 例。研究表明，除吸烟、酗酒、高红肉和加工肉摄入等环境危险因素以外，遗传变异和表观遗传学改变也与结直肠癌的发生发展密切相关。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)作为遗传变异中最常见的一种形式，指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多样性，其与多种肿瘤的易感性相关。因此，筛选具有遗传易感性的结直肠癌高危人群，进而对其采取针对性的预防措施，对降低结直肠癌发病率和死亡率具有重要意义。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是指长度超过 200 个核苷酸(nt)，且不具有编码蛋白质功能的 RNA 分子。基因组上lncRNA单核苷酸多态性可能改变lncRNA自身的表达水平或影响其与目标序列/蛋白结合，继而影响肿瘤的发生发展。MALAT1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，肺腺癌转移相关转录本 1)是一个高度保守的 lncRNA，定位于人染色体11q13.1，全长约8000nt。研究表明，MALAT1在结直肠癌的发生发展过程中发挥促癌基因的作用，并且与结直肠癌患者的不良预后有关。此外，MALAT1单核苷酸多态性与肝细胞癌，乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的发病风险存在关联。但是，目前尚缺乏MALAT1单核苷酸多态性位点与结直肠癌发病风险之间的关联研究。本课题通过生物信息学分析筛选MALAT1上具有潜在功能的单核苷酸多态性位点，并探索MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌易感性的关联及其可能存在的分子机制。
研究方法
一、MALAT1 rs664589与结直肠癌发病风险的关联性研究
1、应用LNCipedia数据库获取MALAT1在染色体上的位置，接着根据以下筛选标准筛选该位置上的候选单核苷酸多态性位点：(1)汉族人群中最小等位基因频率(Minor Allele Frequencies, MAF)>0.05；(2)可影响MALAT1和miRNAs结合的位点；(3)可改变MALAT1的二级结构。利用Haploview软件对MALAT1基因上的单核苷酸多态性位点进行连锁不平衡分析。
2、纳入1078例结直肠癌患者(病例组)和1175例健康对照人群(对照组)开展病例对照研究，采用TaqMan探针法对MALAT1候选单核苷酸多态性位点进行基因分型。利用卡方检验和logistic回归模型探讨MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌发病风险的关联性。
3、采用分层分析进一步评估年龄、性别、肿瘤位置等临床病理特征对MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌发病风险关联的影响。
4、利用单因素COX回归分析模型和Kaplan-Meier法分析MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌患者生存时间的关联。
5、采用分层分析进一步评估年龄、性别、肿瘤位置等临床病理特征对MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌患者生存时间关联的影响。
二、rs664589对MALAT1在结直肠癌中表达的影响
1、构建结直肠癌组织和相应癌旁组织芯片(包括1078例结直肠癌患者中807对结直肠癌和癌旁组织)，利用RNAscope技术检测MALAT1在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达水平。
2、采用 Kaplan-Meier 法探究 MALAT1 表达水平与结直肠癌患者生存时间的关系。
3、TaqMan探针法对 96 个结直肠癌患者全基因组 DNA进行基因分型，并用 qRT-PCR检测MALAT1在96对结直肠癌和癌旁组织中的表达水平。
4、使用单因素方差分析检测rs664589 CC/CG/GG三种基因型与MALAT1表达水平的关系。
三、rs664589对结直肠癌细胞表型的影响
1、利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白 9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9), CRISPR/Cas9)基因编辑技术对野生型结直肠癌SW480和SW620细胞(均携带rs664589 CC基因型)MALAT1 rs664589进行定点突变，构建rs664589 CC/CG/GG三种基因型的细胞系。
2、在此基础上分析MALAT1 rs664589对结直肠癌细胞表型的影响，包括细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，Transwell实验检测迁移和侵袭能力，裸鼠荷瘤实验评估MALAT1 rs664589对结直肠癌细胞裸鼠体内荷瘤能力的影响。
主要研究结果
一、MALAT1 rs664589与结直肠癌发病风险的关联性研究
1、基因分型结果表明，与携带rs664589 CC基因型个体相比，携带rs664589 CG基因型个体罹患结直肠癌的风险升高了35%(调整OR值 =1.35，95%CI=1.08-1.69)，携带rs664589 GG基因型个体罹患结直肠癌的风险升高了257%(调整OR值 =3.57，95%CI=1.60-7.97)。在显性模型中，携带rs664589 CG/GG基因型个体罹患结直肠癌的风险比携带CC基因型者增加了45%(CG/GG vs. CC：调整OR值 =1.45，95%CI=1.16-1.80)。然而，rs3200401 三种基因型在病例和对照组中的频数分布差异无统计学意义(P=0.1923)。
2、MALAT1 rs664589与结直肠癌发病风险关联性的分层分析结果显示，在年龄≤56岁、年龄>56岁和男性亚组中，携带rs664589 CG和GG基因型的个体发生结直肠的风险性分别是携带rs664589CC基因型个体的1.48倍(P=0.0086，调整OR值 =1.48，95%CI=1.10-1.99、1.41倍(P=0.0346，调整OR值 =1.41，95%CI=1.02-1.95)和1.57倍(P=0.0015，调整OR值 =1.57，95%CI=1.19-2.08)。此外，我们发现rs664589 CG/GG基因型与结肠癌(P=0.0038，调整OR值 =1.48，95%CI=1.12-1.94)、直肠癌(P=0.0065，调整OR值 =1.43，95%CI=1.11-1.85)、低分化结直肠癌(P=0.001，调整OR值 =1.96， 95%CI=1.47-2.61)、结直肠癌侵及肌层或浆膜下(T2)(P=0.001，调整OR值 =1.96，95%CI=1.44-2.67)、淋巴结转移(P=0.001，调整OR值 =2.41，95%CI=1.86-3.11)、远端转移(P=0.001，调整OR值 =3.63，95%CI=2.43-5.42)以及TNM分期III(P=0.001，调整OR值 =2.12，95%CI=1.60-2.81)、IV(P=0.001，调整OR值 =3.63，95%CI=2.43-5.42)等风险增加相关联。
3、在MALAT1 rs664589与结直肠癌患者生存时间的关联性研究中，KM分析发现与携带rs664589 CC基因型患者相比，携带rs664589 CG/GG基因型患者的生存时间显著减少(CG/GG vs. CC：调整HR值 =2.01，95%CI=1.68-2.40)。
4、MALAT1 rs664589与结直肠癌患者生存时间关联性的分层分析结果表明，在除了T1、T2浸润深度以及TNM I期亚组以外的其他亚组中，与携带rs664589 CC基因型患者相比，携带rs664589 CG/GG基因型患者的生存时间显著降低。
二、rs664589对MALAT1在结直肠癌中表达的影响
1、RNAscope检测结果显示，结直肠癌患者癌组织中MALAT1的表达水平显著高于自体癌旁组织(P<0.001)。
2、KM分析结果表明，相对于MALAT1低表达的结直肠癌患者，MALAT1高表达的结直肠癌患者生存时间缩短(log-Rank P<0.001)。
3、单因素方差分析结果表明，携带rs664589 CG/GG基因型患者结直肠癌组织和癌旁组织芯片中MALAT1表达水平显著高于携带rs664589 CC基因型患者(P<0.001)。在96 对新鲜结直肠癌和癌旁组织中，携带携带 rs664589 CG/GG 基因型患者癌组织中MALAT1的表达水平显著高于rs664589 CC基因型患者 (P<0.001)，但在癌旁组织中不同基因型患者MALAT1表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。
三、rs664589对结直肠癌细胞表型的影响
1、细胞克隆实验表明携带 rs664589 CG/GG 基因型结直肠癌 SW480(P < 0.001)和SW620(P < 0.001)细胞的克隆形成能力显著高于携带rs664589 CC基因型的结直肠癌细胞。
2、细胞迁移和侵袭实验表明，携带 rs664589 CG/GG 基因型结直肠癌 SW480(P <0.001)和SW620(P < 0.001)细胞的侵袭和迁移能力显著高于携带rs664589 CC基因型的结直肠癌细胞。
3、裸鼠荷瘤实验表明，我们发现rs664589 CG/GG基因型结直肠癌SW480(P<0.001)和SW620(P<0.001)细胞的体内成瘤能力显著高于携带rs664589 CC基因型的结直肠癌细胞。
研究结论
1. MALAT1 rs664589 C>G增加了个体罹患结直肠癌的风险性，降低了结直肠癌患者的生存时间。
2. MALAT1在结直肠癌中表达上调，与结直肠癌患者的生存时间减少有关。
3. MALAT1 rs664589 C>G可以促进MALAT1在结直肠癌中的表达。
4. MALAT1 rs664589 C>G可增强结直肠癌细胞恶性表型，促进结直肠癌发展。
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上最常见的癌症之一，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。据报道，2015年我国结直肠癌新增病例约为376，300例，死亡病例约为 191，000 例。研究表明，除吸烟、酗酒、高红肉和加工肉摄入等环境危险因素以外，遗传变异和表观遗传学改变也与结直肠癌的发生发展密切相关。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)作为遗传变异中最常见的一种形式，指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多样性，其与多种肿瘤的易感性相关。因此，筛选具有遗传易感性的结直肠癌高危人群，进而对其采取针对性的预防措施，对降低结直肠癌发病率和死亡率具有重要意义。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是指长度超过 200 个核苷酸(nt)，且不具有编码蛋白质功能的 RNA 分子。基因组上lncRNA单核苷酸多态性可能改变lncRNA自身的表达水平或影响其与目标序列/蛋白结合，继而影响肿瘤的发生发展。MALAT1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，肺腺癌转移相关转录本 1)是一个高度保守的 lncRNA，定位于人染色体11q13.1，全长约8000nt。研究表明，MALAT1在结直肠癌的发生发展过程中发挥促癌基因的作用，并且与结直肠癌患者的不良预后有关。此外，MALAT1单核苷酸多态性与肝细胞癌，乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的发病风险存在关联。但是，目前尚缺乏MALAT1单核苷酸多态性位点与结直肠癌发病风险之间的关联研究。本课题通过生物信息学分析筛选MALAT1上具有潜在功能的单核苷酸多态性位点，并探索MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌易感性的关联及其可能存在的分子机制。
研究方法
一、MALAT1 rs664589与结直肠癌发病风险的关联性研究
1、应用LNCipedia数据库获取MALAT1在染色体上的位置，接着根据以下筛选标准筛选该位置上的候选单核苷酸多态性位点：(1)汉族人群中最小等位基因频率(Minor Allele Frequencies, MAF)>0.05；(2)可影响MALAT1和miRNAs结合的位点；(3)可改变MALAT1的二级结构。利用Haploview软件对MALAT1基因上的单核苷酸多态性位点进行连锁不平衡分析。
2、纳入1078例结直肠癌患者(病例组)和1175例健康对照人群(对照组)开展病例对照研究，采用TaqMan探针法对MALAT1候选单核苷酸多态性位点进行基因分型。利用卡方检验和logistic回归模型探讨MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌发病风险的关联性。
3、采用分层分析进一步评估年龄、性别、肿瘤位置等临床病理特征对MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌发病风险关联的影响。
4、利用单因素COX回归分析模型和Kaplan-Meier法分析MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌患者生存时间的关联。
5、采用分层分析进一步评估年龄、性别、肿瘤位置等临床病理特征对MALAT1候选单核苷酸多态性位点与结直肠癌患者生存时间关联的影响。
二、rs664589对MALAT1在结直肠癌中表达的影响
1、构建结直肠癌组织和相应癌旁组织芯片(包括1078例结直肠癌患者中807对结直肠癌和癌旁组织)，利用RNAscope技术检测MALAT1在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达水平。
2、采用 Kaplan-Meier 法探究 MALAT1 表达水平与结直肠癌患者生存时间的关系。
3、TaqMan探针法对 96 个结直肠癌患者全基因组 DNA进行基因分型，并用 qRT-PCR检测MALAT1在96对结直肠癌和癌旁组织中的表达水平。
4、使用单因素方差分析检测rs664589 CC/CG/GG三种基因型与MALAT1表达水平的关系。
三、rs664589对结直肠癌细胞表型的影响
1、利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白 9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9), CRISPR/Cas9)基因编辑技术对野生型结直肠癌SW480和SW620细胞(均携带rs664589 CC基因型)MALAT1 rs664589进行定点突变，构建rs664589 CC/CG/GG三种基因型的细胞系。
2、在此基础上分析MALAT1 rs664589对结直肠癌细胞表型的影响，包括细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，Transwell实验检测迁移和侵袭能力，裸鼠荷瘤实验评估MALAT1 rs664589对结直肠癌细胞裸鼠体内荷瘤能力的影响。
主要研究结果
一、MALAT1 rs664589与结直肠癌发病风险的关联性研究
1、基因分型结果表明，与携带rs664589 CC基因型个体相比，携带rs664589 CG基因型个体罹患结直肠癌的风险升高了35%(调整OR值 =1.35，95%CI=1.08-1.69)，携带rs664589 GG基因型个体罹患结直肠癌的风险升高了257%(调整OR值 =3.57，95%CI=1.60-7.97)。在显性模型中，携带rs664589 CG/GG基因型个体罹患结直肠癌的风险比携带CC基因型者增加了45%(CG/GG vs. CC：调整OR值 =1.45，95%CI=1.16-1.80)。然而，rs3200401 三种基因型在病例和对照组中的频数分布差异无统计学意义(P=0.1923)。
2、MALAT1 rs664589与结直肠癌发病风险关联性的分层分析结果显示，在年龄≤56岁、年龄>56岁和男性亚组中，携带rs664589 CG和GG基因型的个体发生结直肠的风险性分别是携带rs664589CC基因型个体的1.48倍(P=0.0086，调整OR值 =1.48，95%CI=1.10-1.99、1.41倍(P=0.0346，调整OR值 =1.41，95%CI=1.02-1.95)和1.57倍(P=0.0015，调整OR值 =1.57，95%CI=1.19-2.08)。此外，我们发现rs664589 CG/GG基因型与结肠癌(P=0.0038，调整OR值 =1.48，95%CI=1.12-1.94)、直肠癌(P=0.0065，调整OR值 =1.43，95%CI=1.11-1.85)、低分化结直肠癌(P=0.001，调整OR值 =1.96， 95%CI=1.47-2.61)、结直肠癌侵及肌层或浆膜下(T2)(P=0.001，调整OR值 =1.96，95%CI=1.44-2.67)、淋巴结转移(P=0.001，调整OR值 =2.41，95%CI=1.86-3.11)、远端转移(P=0.001，调整OR值 =3.63，95%CI=2.43-5.42)以及TNM分期III(P=0.001，调整OR值 =2.12，95%CI=1.60-2.81)、IV(P=0.001，调整OR值 =3.63，95%CI=2.43-5.42)等风险增加相关联。
3、在MALAT1 rs664589与结直肠癌患者生存时间的关联性研究中，KM分析发现与携带rs664589 CC基因型患者相比，携带rs664589 CG/GG基因型患者的生存时间显著减少(CG/GG vs. CC：调整HR值 =2.01，95%CI=1.68-2.40)。
4、MALAT1 rs664589与结直肠癌患者生存时间关联性的分层分析结果表明，在除了T1、T2浸润深度以及TNM I期亚组以外的其他亚组中，与携带rs664589 CC基因型患者相比，携带rs664589 CG/GG基因型患者的生存时间显著降低。
二、rs664589对MALAT1在结直肠癌中表达的影响
1、RNAscope检测结果显示，结直肠癌患者癌组织中MALAT1的表达水平显著高于自体癌旁组织(P<0.001)。
2、KM分析结果表明，相对于MALAT1低表达的结直肠癌患者，MALAT1高表达的结直肠癌患者生存时间缩短(log-Rank P<0.001)。
3、单因素方差分析结果表明，携带rs664589 CG/GG基因型患者结直肠癌组织和癌旁组织芯片中MALAT1表达水平显著高于携带rs664589 CC基因型患者(P<0.001)。在96 对新鲜结直肠癌和癌旁组织中，携带携带 rs664589 CG/GG 基因型患者癌组织中MALAT1的表达水平显著高于rs664589 CC基因型患者 (P<0.001)，但在癌旁组织中不同基因型患者MALAT1表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。
三、rs664589对结直肠癌细胞表型的影响
1、细胞克隆实验表明携带 rs664589 CG/GG 基因型结直肠癌 SW480(P < 0.001)和SW620(P < 0.001)细胞的克隆形成能力显著高于携带rs664589 CC基因型的结直肠癌细胞。
2、细胞迁移和侵袭实验表明，携带 rs664589 CG/GG 基因型结直肠癌 SW480(P <0.001)和SW620(P < 0.001)细胞的侵袭和迁移能力显著高于携带rs664589 CC基因型的结直肠癌细胞。
3、裸鼠荷瘤实验表明，我们发现rs664589 CG/GG基因型结直肠癌SW480(P<0.001)和SW620(P<0.001)细胞的体内成瘤能力显著高于携带rs664589 CC基因型的结直肠癌细胞。
研究结论
1. MALAT1 rs664589 C>G增加了个体罹患结直肠癌的风险性，降低了结直肠癌患者的生存时间。
2. MALAT1在结直肠癌中表达上调，与结直肠癌患者的生存时间减少有关。
3. MALAT1 rs664589 C>G可以促进MALAT1在结直肠癌中的表达。
4. MALAT1 rs664589 C>G可增强结直肠癌细胞恶性表型，促进结直肠癌发展。