论文部分内容阅读
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是中国乃至世界第一大糖料作物,世界上的食糖生产绝大部分以甘蔗为原料。干旱已成为我国甘蔗单产低、品质差的主要原因之一。解决这个问题的有效途径之一是培育和利用优良的耐旱甘蔗品种。甘蔗作为一种高度杂合、遗传背景复杂的无性繁殖作物,常规的抗旱选育方法盲目性大,周期长,效果也有限。植物基因工程技术的发展为解决这一困难提供了新途径,使在优良品种中导入外源基因进行品种遗传改良成为可能。DREB即干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding),是参与植物对干旱、高盐等非生物胁迫应答,调节植物体内产生各种生理代谢反应的关键因子,能特异结合DRE/CRT顺式作用元件,激活下游基因的表达,从而提高植株的抗逆性。为此,本研究利用基因枪轰击法把从甘蔗近缘属植物斑茅中克隆得到的EaDREB2B基因导入受体品种福农95-1702;在经分子检测获得转基因甘蔗无性系的基础上,对其进行抗旱性综合评价,从中选择抗旱性表现优异的转基因无性系进行抗旱相关基因表达调控的初步探讨和研究;并对转基因甘蔗后代目的基因的遗传稳定性与工农艺性状表现进行了初步评价。主要的研究内容与结果如下:1.利用拟南芥中克隆得到的rd29A诱导型启动子,成功构建2个植物诱导型表达载体,其中一个载体prd29a-dreb-hyg的标记基因为潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin)基因,另一个载体pDREB-PMI的标记基因为磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,pmi)基因。2.通过潮霉素浓度梯度筛选预试验,建立了甘蔗品种福农95-1702遗传转化筛选方案。对于基因枪法,采用延迟筛选的方式,愈伤组织轰击后恢复培养5-8 d,然后转入含有20 mg/L潮霉素的愈伤组织继代培养基上进行筛选,两周后将潮霉素浓度提高到30 mg/L,再经过2~3次继代筛选,选择存活的抗性愈伤组织转至含25 mg/L潮霉素的分化培养基上进行光照分化筛选,两周后将潮霉素浓度提高到35 mg/L,经过3~4次继代分化筛选,将获得的再生绿苗转至含25 mg/L潮霉素生根培养基上进行筛选和生根培养。通过分析基因枪轰击次数对转化效率的影响,结果表明:每轰击一枪后转动培养皿的方向,并翻动受体材料,2枪轰击的效果较好。3.利用基因枪法将植物表达载体prd29a-dreb-hyg转化甘蔗愈伤1600个,经过抗生素筛选,共获45株抗性苗,转化再生频率为2.8%。通过PCR、点杂交、Southern杂交以及RT-PCR检测,结果表明有4株为阳性转基因无性系。4.以受体品种和空载体转化获得的植株后代为对照,分析转基因甘蔗伸长初期干旱胁迫下叶片内的丙二醛含量、可溶性糖含量和相对质膜透性,以及胁迫后的株高伤害率变化。结果表明:干旱胁迫下,转基因甘蔗和对照植株的MDA含量的升高,但转基因型植株的升高量要低于对照植株;转基因甘蔗产生更多的可溶性糖来抵抗干旱胁迫;转基因甘蔗与对照植株的质膜相对透性上升,但转基因甘蔗相对电导率的增幅显著小于对照植株;转基因株系的株高伤害率要低于对照。对干旱和高盐胁迫处理下的转基因植株与对照表型特征进行观察,结果发现:转基因植株的抗旱性与耐盐性较对照植株明显提高。利用模糊隶属函数法对参试材料进行抗旱性综合评价,结果表明:抗旱性从强到弱分别为4>16>13>44>空载>原种,说明干旱胁迫下外源EaDREB2B基因的导入提高了甘蔗的抗旱能力。5.以抗旱性表现优异的转基因无性系4号为材料,利用实时荧光定量PCR的方法分析了EaDREB2B基因和几个甘蔗抗旱相关基因在PEG胁迫下的转录表达情况。不同胁迫时间的试验结果显示,EaDREB2B基因在胁迫6h后表达量达到最大值,该基因在根中表达量明显高于茎叶,基因表达具有组织特异性;P5CS基因在转基因甘蔗水分胁迫初期和中期被诱导上调表达;CaM基因在转基因甘蔗水分胁迫初期被诱导上调表达;其他两个基因SAMDC和BADH基因在转基因甘蔗水分胁迫下相对表达量和对照非转基因相比基本无差异。6.利用PCR、RT-PCR检测技术对转EaDREB2B基因甘蔗三个世代无性系进行分子检测,证明转基因甘蔗中的外源EaDREB2B基因经过三个世代的无性繁殖稳定遗传。对T2代转基因甘蔗主要的农艺性状和品质性状进行调查与分析,结果表明:伸长期期间,转基因甘蔗的生长速度快于非转基因甘蔗;除了丛有效茎数外,转基因甘蔗的茎径、株高和单茎重都要高于非转基因甘蔗;转基因甘蔗的蔗糖分、蔗汁锤度、蔗汁蔗糖分等其他品质性状都有所提高。7.通过研究甘露糖对甘蔗外植体再生体系的影响,明确其用于甘蔗遗传转化筛选的最适浓度。研究结果表明:甘露糖对甘蔗愈伤组织诱导、愈伤组织分化和幼芽根形成均产生抑制作用,愈伤组织生长、分化、生根3个阶段的抗性筛选浓度分别为3-5、4-5和3 g/L。本研究以甘蔗品种福农95-1702为受体材料,利用基因枪轰击法将植物表达载体pDREB-PMI转化甘蔗愈伤1200个,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。通过PCR、点杂交、RT-PCR以及氯酚红(CPR)检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。