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目的:人舌鳞状细胞癌(TSCC—tongue squamous cell carcinoma)是口腔颌面颈部中最常见的上皮性恶性肿瘤,在多种口腔颌面部恶性肿瘤中的致死率排名第一。目前常规的治疗方法主要以手术为主,同时辅助化学治疗、放射治疗和分子靶向治疗、生物治疗、中医药治疗等。舌鳞状细胞癌具有很强的侵袭性和转移性,使其复发率和死亡率一直处于非常高的状态。肿瘤的EMT过程在舌鳞状细胞癌的恶性生长和转移过程中起着十分重要的作用,这也是导致治疗失败的最重要的原因。因此,阻断恶性肿瘤的EMT过程,已成为舌鳞状细胞癌目前阶段的治疗研究热点。IL-8,也称为CXCL8,是C-X-C趋化因子家族的重要成员之一,也是参与TSCC发病、发展的主要炎症因子之一。IL-8能够促进肿瘤的生长、侵袭、扩散,是一种自分泌生长因子,与肿瘤局部的微环境关系极为密切,特别是肿瘤的炎症反应。目前临床上普遍认为,IL-8的增高,可以加速肿瘤组织的血管生成,促进肿瘤细胞的迁移和侵袭,从而促进了恶性肿瘤的进展,这提示了,在肿瘤的微环境中,IL-8很可能是肿瘤发生、发展的重要生物标志物之一。IL-8可以与细胞表面G蛋白偶联受体,如CXCR1、CXCR2结合,参与多种生物学功能。目前临床上已经证实,IL-8/CXCR2信号轴可以促进多种恶性肿瘤的转移与侵袭,并且可能是通过调节恶性肿瘤的EMT过程(上皮-间质转化过程)来完成的。NF-κB(nuclear factor-kappa B),又称为核转录因子,是一组可以和细胞内某些特定基因上的核苷酸序列发生特异性结合,从而启动基因转录、表达功能的蛋白质,是TGF-β诱导EMT发生的一个重要分子。NF-κB在细胞的免疫、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等多种生理和病理过程中均扮演着至关重要的角色。NF-κB的激活是肿瘤转移过程中发生EMT的一个基本要求,而且同时伴随着IL-8的高表达。除此之外,慢性炎症反应和NF-κB的激活,是恶性肿瘤EMT过程的必需条件。目前,对于IL-8/CXCR2信号轴是否通过NF-κB通路激活TSCC细胞的转移与侵袭能力及EMT过程仍未见报道。受上述研究的启发,我们可以推断,IL-8/CXCR2信号轴可以通过调节NF-κB通路来影响TSCC细胞的EMT过程。本研究首先研究沉默IL-8受体CXCR2是否能够抑制IL-8诱导的TSCC细胞转移与侵袭的影响,以及通过调节NF-κB通路对TSCC细胞转移与侵袭的影响,并探讨其与舌鳞状细胞癌的上皮间质化的关系,探讨其潜在机制。研究方法:1.体外培养人TSCC细胞系Tscca和Tca8113。使用人重组IL-8(10ng/ml)处理细胞,实验具体分组为:Blank组,IL-8组,处理完成后,收集细胞。Transwell实验(matrigel基质胶)检测TSCC在IL-8刺激下的细胞侵袭能力。划痕实验检测TSCC在IL-8刺激下的细胞迁移能力。Western blot实验(蛋白印迹试验)检测TSCC在IL-8刺激下的EMT的相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Twist)的表达情况。2.体外培养人TSCC细胞系Tscca和Tca8113,通过干扰RNA(siRNA)使CXCR2的表达沉默,使用人重组IL-8(10 ng/ml)处理细胞,实验具体分组为:Blank组,IL-8组,IL-8+NC组,IL-8+CXCR2-Si1组,IL-8+CXCR2-Si2。处理完成后,收集细胞。real time PCR(实时荧光定量PCR)和Western blot实验检测CXCR2敲减效率,Transwell实验(matrigel基质胶)检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移,细胞免疫荧光检测NF-κB p65表达,Western blot检测EMT相关蛋白表达情况。3.使用人重组IL-8(10 ng/ml)+PDTC(pyrrolidine dithiocarbonate)(100μM)共处理细胞,实验具体分组为:Blank组,IL-8组,IL-8+PDTC。处理完成后,收集细胞。通过Transwell实验(200×)分析PDTC(100μM)处理的TSCC细胞侵袭能力,EMSA实验(电泳迁移率偏移分析)检测核NF-κB p65在PDTC(100μM)处理后对DNA结合活性的变化,Western blot检测EMT相关蛋白的变化情况,分析PDTC对EMT的影响。结果:1.通过进行细胞划痕实验发现,与Blank组相比,IL-8组的细胞迁移百分比明显增高。通过Transwell实验发现,与Blank组相比,IL-8组的穿膜细胞个数显著增加。IL-8刺激后与Blank组比较,Tscca细胞和Tca8113细胞E-cadherin蛋白表达水平显著降低,N-cadherin蛋白和Twist蛋白表达水平显著升高。2.通过Real-timePCR检测Tscca和Tca8113细胞经过CXCR2siRNA转染后,CXCR2的mRNA表达水平,转染CXCR2-Si片段后,CXCR2的mRNA的表达量显著降低。采用Western blot实验检测CXCR2蛋白表达水平的变化,Tscca和Tca8113细胞在CXCR2-Si片段干扰后,CXCR2蛋白表达量显著降低。采用细胞划痕实验检测用CXCR2敲低后对IL-8(10ng/mL)刺激的Tscca和Tca8113细胞迁移能力的影响,与Blank组比较,IL-8刺激后的TSCC细胞迁移均显著增加;而与Control组比较,CXCR2敲低后,TSCC细胞迁移均显著降低;IL-8刺激后,Tscca细胞与Tca8113细胞的穿膜细胞个数较空白组显著增加;CXCR2敲低后,与Control组比较,穿膜细胞个数显著降低。3.Tscca细胞与Tca8113细胞在IL-8和CXCR2-Si片段处理后,采用细胞免疫荧光检测NF-κB p65表达情况,IL-8刺激后与Blank组比较,NF-κB p65表达量增加;而CXCR2-Si处理后与control组比较,NF-κB p65表达明显减少。采用Western blot检测EMT相关蛋白表达情况,IL-8刺激后与Blank组比较,Tscca细胞和Tca8113细胞E-cadherin蛋白表达水平显著降低,N-cadherin蛋白和Twist蛋白表达水平显著升高;IL-8刺激后进行CXCR2干扰处理,与Control组比较,Tscca细胞和Tca8113细胞E-cadherin蛋白表达水平显著升高,N-cadherin蛋白和Twist蛋白表达水平显著降低。4.通过Transwell实验分析PDTC(100μM)处理的TSCC细胞侵袭能力,与Blank组比较,IL-8组穿膜细胞数量显著增加,而经过PDTC处理后,与IL-8组比较,穿膜细胞数量显著降低;EMSA实验检测核NF-κB p65在PDTC(100μM)处理后对DNA结合活性的变化,Tscca细胞和Tca8113细胞在IL-8刺激后,核内NF-κB p65活性显著增高,而PDTC抑制了NF-κB p65活性,与IL-8组比较,IL-8+PDTC组NF-κB p65活性显著降低;Western blot检测EMT相关蛋白的变化情况,分析PDTC对EMT的影响,IL-8刺激后与Blank组比较,Tscca细胞和Tca8113细胞E-cadherin蛋白表达水平显著降低,N-cadherin蛋白和Twist蛋白表达水平显著升高,IL-8+PDCT处理后,与IL-8组比较,IL-8+PDTC组E-cadherin蛋白表达水平显著升高,N-cadherin蛋白和Twist蛋白表达水平显著降低。结论:1.IL-8能够增强TSCC细胞的细胞迁移能力和细胞侵袭能力,并且抑制了TSCC细胞的上皮间质转化(EMT)过程。2.通过沉默CXCR2,降低了TSCC细胞的迁移能力和侵袭能力。沉默CXCR2可减少NF-κB的活化,抑制E-cadherin的丧失和N-cadherin,Twist的表达,从而抑制了上皮间质转化(EMT)过程。3.PDTC,一种NF-κB抑制剂,也显著地抑制了TSCC细胞的EMT过程和了TSCC细胞的侵袭能力。所以,我们得出结论,IL-8/CXCR2信号轴可以通过调节NF-κB通路,调控TSCC细胞的转移、侵袭和EMT过程。