研究背景和目的微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的内源性单链非编码小分子RNA。作为一类重要的调节分子,其通过完全或不完全互补的方式与靶mRNA的3’端非编码区结合,从而发挥基因转录后的调控作用。从第一个miRNA被发现至今,短短20余年的时间,已发现来自不同物种的超过17000种miRNAs,且有关miRNA的研究也取得突飞猛进的进展。研究表明,miRNA在一系列的病理生理过程中发挥着重要的作用,且miRNA的表达与许多疾病的发生发展有着密切的联系,如,感染、自身免疫紊乱、心血管疾病以及癌症等。此外,越来越多证据表明,miRNA不仅存在于生物细胞内还存在于许多种体液如血液、尿液以及唾液等中,且其存在非常的稳定。因而,miRNA被认为是一类具有广阔应用前景的新型生物标志物,有望用于疾病的诊断、治疗及预后判断等。虽然miRNA的存在非常广泛,在许多的生物样品中均可检测到。但是做为理想的生物标志物,往往要求所分析的样品具备以下两个特点。首先,也是最重要的是,要求样品具备易获得性,取材过程简单易行且不需要昂贵的器械。其次,则是要求分析对象具备短时间内可重复采集性,因为这对于了解疾病的进展及实时监测至关重要。鉴于此,当前许多的科学工作者将miRNA的研究目光逐渐从细胞及组织转移到血液样品上,并且发现了许多疾病相关的循环miRNA。然而,与当前已广泛应用的蛋白类生物标记不同的是,循环miRNA在血液中并不是以游离的形式存在。而是主要以下三种方式:(1)包裹在一些具有膜结构的微球当中,如微囊泡、外泌体及凋亡小体等。(2)与Ago2蛋白形成核酸蛋白复合物。(3)与载脂蛋白结合形成脂蛋白复合物。这使得循环miRNA在定量分析过程中,高效的分离和纯化过程必不可少。目前,常用的miRNA提取技术包括传统的基于TRIzol试剂的提取法、酚氯仿法以及一些基于柱式分离的试剂盒法等。在这些方法当中,TRIzol法因其具有经济、方便的特点而得到广泛的应用。但同时由于其并非专门的miRNA提取方法,因而存在提取效率不高的缺点。在组织及细胞内miRNA提取时,因丰度较高,该方法尚能胜任。但若将其用于血液中循环miRNA提取时,则无法满足下游定量分析的需求。目前,虽然很多商业试剂盒的出现在一定程度上解决的血液样品中miRNA提取效率不足的问题,但是其昂贵的费用限制它们的广泛应用。因此,在本研究中,我们通过对传统的基于TRIzo试剂的RNA提取方法进行深入的研究,同时结合miRNA自身的一些特点,提出将传统的RNA提取方法进行改良使其适用于血清miRNA的提取。然后分别通过将其与传统TRIzol法以及两种常用的代表性的方法进行比对分析,评估其提取效能,以期为血清miRNA的研究提供一个新的有利的研究工具。另一方面,对于miRNA作为疾病标志物的临床应用发展来说,一个好的定量分析方法也同样重要。因为与其它核酸检测不同,miNRA的一些独特特性,如序列短、丰度低、家族内相似度高等特点使得其难以被检测。在过去的十几年中,已有陆续出现许多miRNA定量分析方法,在这些方法中印迹杂交技术被认为是miRNA检测的金标准。然而由于其比较耗时、样品消耗大且灵敏度不高使得其未得到广泛的应用。miRNA微阵列技术是另一种miRNA分析的传统方法。其具有高通量分析的能力,但同时受制于灵敏度低、反应时间长等缺点,也未得到大面积的推广。至于当前广泛应用的荧光定量PCR法,虽然足够灵敏,但存在操作复杂、耗时较长且依赖高昂仪器等缺点。综上所述,我们可以看出,开发一种灵敏度高、特异性好且方便快捷的miRNA分析方法,对于进一步推进miRNA相关研究以及其临床应用,进而发挥出miRNA作为新型生物标志物的巨大社会应用价值具有非常重要的意义。鉴于此,在本研究中,我们结合双链特异性核酸酶可特异性识别完全互补配对的RNA/DNA双链并高效酶切的能力,以及DNA/2-OMe-RNA嵌合探针介导的级联信号放大系统,初步创建出一种灵敏度与特异性兼备的miRNA荧光检测新方法。并同时对其检测特异性、灵敏度及实际样品检测能力进行评价,以期为miRNA定量检测方法的发展提供新的思路。研究方法1.传统TRIzol法提取血清microRNA的改良及评价1.1通过对传统TRIzol法提取步骤的深入研究,结合miRNA的理化及存在特性创建出适合血清样品miRNA提取的改良方法,即改良TRIzol法。1.2将改良TRIzol法、传统方法及两种部分改良方法进行比对分析,分别评价个方法的提取效率,从而验证改良的有效性。1.3将改良TRIzol法与另外两种当前常用的miRNA提取方法(一步酸性酚法、miVanaTM miRNA试剂盒法)进行方法学比对分析,从而评价改良TRIzol法的提取效能和实际应用能力。2.双链特异性核酸酶介导的高灵敏度、高特异性miRNA检测新方法的构建及其初步评价2.1利用Primer Premier分子生物学设计软件,设计并合成出体系所需的各类核酸探针。2.2利用琼脂糖凝胶电泳技术对双链特异性核酸酶的酶促产物进行分析,考察其对于2-OMe-RNA/DNA杂合双链的识别及酶切能力,从而验证DNA/2-OMe-RNA嵌合探针用于miRNA检测体系的可行性。2.3通过一定的处理,将3’修饰有生物素的DNA/2-OMe-RNA嵌合探针固定到链霉亲和素磁珠表面,制备出实验所需的功能化磁珠。然后用激光共聚焦显微镜对探针的固定情况进行表征。2.4比较不同孵育温度、DNA加入量、Taqman探针浓度等条件下,体系所产生荧光信号的变化,优化出最佳反应条件。2.5在最佳条件下,用所构建的方法对倍比稀释的miRNA-21标准品进行检测,记录实验结果并进行统计分析,从而得到方法的检测下限及线性范围。2.6用所构建方法同时对相同浓度的miRNA-21以及几种不同错配程度的RNA序列(M1、M2、M3、M4以及miRNA-141)进行荧光检测,对比荧光信号强度,从而验证所构建方法的检测特异性。2.7选取三种常见肿瘤细胞系,提取RNA,用所构建方法及实时荧光定量PCR法同时进行miRNA分析。以PCR法为参考,对所构建方法的实际应用能力进行评价。结果1.传统TRIzol法提取血清microRNA的改良及评价1.1在创建出改良的提取方法后,我们将其与传统TRIzol法以及两种部分改良方法经行对比,得出改良TRIzol法在RNA提取纯度及产量方面均有明显的提高,且能够有效的降低后续PCR定量分析的Ct值。1.2将改良TRIzol法与两种当前常用的miRNA提取方法(一步酸性酚法、miVanaTM miRNA试剂盒法)进行比对分析的结果显示,改良TRIzol在提取效率方面有着一定的优势,从而验证了该方法的可靠性及实际应用价值。2.双链特异性核酸酶介导的高灵敏度、高特异性miRNA检测新方法的构建及其初步评价2.1用双链特异性核酸酶分别处理DNA/RNA杂交双链以及DNA/2-OMe-RNA双链,酶促产物再用琼脂糖凝胶电泳技术进行分析。结果显示双链特异性核酸酶对这两种杂交双链的酶切作用没有显著的差异。从而证明了 DNA/2-OMe-RNA探针用于miRNA检测体系构建的可行性。2.2利用激光共聚焦显微镜对已固定有探针的功能化磁珠进行表征,结果显示磁珠分散均匀且探针固定情况良好,证明所采用固定方法能够高效的将探针固定到磁珠表面。2.3对所构建检测体系的一些关键检测条件进行优化,结果显示体系的最佳孵育温度为60℃,最佳DSN加入量为0.2U,最适Taqman探针浓度为300nM。2.4在最佳条件下对传感器的检测性能进行评价,得出检测器的检测下限为7.3fM,线性范围为10fM-10pM。检测体系能够有效的区分单个碱基错配,具备优异的检测特异性。最后利用所构建的方法检测三种肿瘤细胞系中miRNA-21的表达量,其结果与荧光定量PCR基本一致,初步证明该方法的检测效能。结论1.建立了一种基于TRIzol试剂的RNA提取改良方法,该方法较传统方法在血清标本RNA提取纯度及产量方面均有明显的提高。相比其它两种当前常见的miRNA提取方法,其在提取效率方面也具备一定的优势,有望成为血清miRNA的研究的一个新的有利工具,特别是对于那些无法用商业试剂盒进行科学研究的研究者来说更是有着重要的意义。2.在结合双链特异性核酸酶可特异识别碱基错配并具有较高的酶促效率,以及DNA/2-OMe-RNA嵌合探针介导的级联信号放大系统突出的信号放大能力的基础上,初步创建出一种灵敏度与特异性兼备的miRNA荧光检测新方法。该方法可检测低至7.3fM的miRNA-21,而且展现出了良好的检测特异性,即便对于单个碱基错配的核酸片段也具有较好的识别能力。同时该方法还具备设计简单、检测方便快捷的优点。在低水平miRNA定量分析方面具备潜在的实用价值。