补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠药动学和抗氧化动力学研究

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目的:本课题为国家自然科学基金项目“脑微透析/激光散斑成像技术与PK/PD结合进行补阳还五汤“益气行血生新”机制的研究(NO.81373973)”的部分研究内容。本课题在结合前期采用体外rBMECs、PC12细胞膜固相色谱法筛选的特异性结合成分,以及体内微透析预实验筛选的补阳还五汤中入脑的成分的基础上,开展补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠的药动学研究。比较不同剂量黄芪的补阳还五汤中有效成分在血液和脑局部的药动学过程。并在补阳还五汤药动学研究的基础上,以血浆中超氧化物歧化酶(SOD),乳酸脱氢酶(LDH)活性为抗氧化能力的指标,评价不同剂量黄芪的补阳还五汤在大鼠体内的药效动力学过程,为补阳还五汤抗脑缺血疾病的临床合理用药提供参考。方法:1.补阳还五汤益气组、活血组的制备及有效成分的含量测定通过水提醇沉法分别制备补阳还五汤益气组和活血组药液,建立益气组中芒柄花素和活血组中芍药苷的HPLC含量测定方法,分别测定药液中有效成分芒柄花素、芍药苷的含量。2.芒柄花素、芍药苷血液和脑在体微透析方法的建立建立HPLC同时测定微透析液中芒柄花素、芍药苷的检测方法,分别采用增量法和减量法考察流速不同流速(0.5,1.0,1.5,2.0 μL/min)、温度(25,30,37,42℃)、药物浓度等因素对芒柄花素、芍药苷血液及脑探针体外回收率的影响,并考察血液探针和脑探针体内回收率的稳定性。3.补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠血液和脑局部药动学研究建立LC-MS/MS同时测定透析液中芒柄花素、芍药苷的检测方法,采用微透析法分别进行低、中、高剂量黄芪的补阳还五汤在MCAO大鼠血液和脑局部药动学的研究。4.补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠的抗氧化动力学研究采用线栓法制备脑缺血损伤大鼠模型,以超氧化物歧化酶(SOD),乳酸脱氢酶(LDH)活性为抗氧化能力的指标,比较低、中、高剂量黄芪的补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠的药效学指标变化。对补阳还五汤中芒柄花素和芍药苷在MCAO模型大鼠体内的药动学过程与补阳还五汤抗氧化作用的相关性进行初步探讨。结果:1.补阳还五汤益气组、活血组的制备及有效成分的含量测定通过水提醇沉法分别制备了实验用补阳还五汤益气组和活血组注射液,三批样品中芒柄花素在补阳还五汤益气方中的含量为:16.53~17.49μg/g;三批样品中芍药苷在补阳还五汤活血方中的含量为:4.44~4.77mg/g。2.芒柄花素、芍药苷血液和脑在体微透析方法的建立芒柄花素,芍血液和脑探针体外回收率随着流速增加而降低,随着温度的升高而升高,与药物浓度无关。当流速为1.5 μL/min时,芒柄花素血液和脑探针RR分别为(29.1±0.61)%和(29.8士1.1)%,芍药苷血液和脑探针RR分别为(41.9±2.4)%和(42.1±0.85)%,探针的体内回收率能在10 h内保持相对稳定,能满足分析的要求。3.补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠血液和脑局部药动学研究建立的UPLC-MS/MS分析方法中,芒柄花素的LLOQ为3.13 ng/mL,线性范围为:3.13~626 ng/mL;芍药苷的LLOQ为17.88 ng/mL,线性范围为:17.88~1788 ng/mL。股静脉注射给药后,补阳还五汤不同给药组中芒柄花素和芍药苷血液药动学过程符合一房室模型模型。高剂量益气组芍药苷药动学参数t1/2blood、MRTblood和MRTbrain延长,在脑组织中的达峰时间加快Tmax(58±6.71 min降至43±4.47 min),并显著增加芍药苷在脑组织中的最大浓度Cmax。中、高剂量益气组芍药苷的AUCbrain显著大于低剂量益气组的AUCbrain,其中高剂量益气组芍药苷的脑靶向效率与低剂量益气组相比具有显著性差异(P<0.05)。4.补阳还五汤在脑缺血损伤大鼠的抗氧化动力学研究造模前大鼠空白血浆中SOD活性为(259.55.±9.37)U/mL,LDH活性为(3636.26±146.09)U/L。模型组大鼠缺血再灌注时血浆中SOD活性显著降低,为(175.58±6.19)U/mL,LDH 活性显著升高,为(5810.54±114.40)U/mL。MCAO大鼠股静脉注射不同黄芪剂量的补阳还五汤后,血浆中SOD活性均增大,LDH活性均降低,相关系数中RSOD较小,且RLDH>RsOD。高剂量黄芪的补阳还五汤体内抗氧化能力较强,其体内抗氧化作用与血浆中芒柄花素、芍药苷浓度呈正相关。结论:补阳还五汤抗脑缺血损伤作用可能与其体内抗氧化作用有关,除了芒柄花素和芍药苷外,其他成分也可能发挥了体内抗氧化的作用。增加益气组黄芪的剂量能提高其体内抗氧化的能力,增强对脑缺血再灌注损伤的保护作用,这可能与高剂量黄芪能延长有效成分在体内和脑组织中的滞留有关。
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