论文部分内容阅读
肿瘤治疗性疫苗和过继性细胞免疫治疗是肿瘤生物治疗研究的热点领域。其中获得性抗原特异性细胞免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗最为理想的方式之一，它是肿瘤治疗性疫苗和过继性细胞免疫治疗两种治疗模式的有机结合，不因患者自身的免疫状态而影响疗效，所输注特异性T淋巴细胞可以有效地靶向肿瘤相关抗原。获得抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)是实施靶向过继性细胞免疫治疗的关键。实现这一目标需要解决两个问题:一是获得肿瘤特异性抗原;二是抗原特异性淋巴细胞的分离和有效扩增。 人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptas， hTERT)是端粒酶的催化活性亚基，被认为是端粒酶激活的主要限制因素。hTERT在肿瘤中的广泛表达而正常成熟组织的细胞很少表达使得人们把hTERT作为肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)，hTERT是与肿瘤生长密切相关的基因产物，在以hTERT为靶点的肿瘤免疫治疗中，肿瘤细胞如为逃避免疫监视而下调hTERT的表达，肿瘤细胞的端粒缩短，细胞调亡，这一变化本身就可以使肿瘤生长抑制，所以hTERT是肿瘤免疫治疗的理想靶位。hTERT虽是自身抗原，但具有较强的免疫原性，机体对其的免疫耐受并不完全，在体内肿瘤形成过程中，肿瘤相关抗原hTERT特异的T细胞既没完全消除，也没有产生不可逆的耐受，通过适当的手段和途径，hTERT特异的T细胞可以被诱导参与肿瘤的免疫治疗。鉴于HLA-A*0201是中国人群中最为常见的HLA-I类分子的型别，阳性率高达30％，因此筛选和鉴定HLA-A*0201限制性hTERT CTL表位，将会对于中国人群中hTERT表达阳性的肿瘤的免疫治疗，具有重要具有现实意义 本论文采用生物信息学和免疫学的方法，预测、筛选和鉴定hTERT新的HLA-A*0201限制性的CTL表位，建立hTERTT细胞表位特异性CTL克隆，研究扩增后的CTL克隆的免疫杀伤功能。 本论文分三部分: 研究一:hTERT的HLA-A*0201限制性CTL表位的生物信息学预测 目的:通过对hTERT进行HLA-A*0201限制性的CTL表位的生物信息学预测，为探索基于hTERT的免疫治疗奠定基础。 方法:联合利用表位预测数据库SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL预测hTERT的HLA-A*0201限制性的CTL表位，并辅助以计算机分子模拟技术对候选肽作进一步预测。 结果:综合SYFPEITHI、BIMAS和etCTL预测结果，选择分值最高6条肽作为候选表位肽，分别是ILAKFLHWL(540-548)，LMSVYVVEL(548-556)，ILSTLLCSL(836-844), CLKELVARV(76-84),LLGASVLGL(675-683),FLDLQVNSL(923-931)。分子模拟的计算结果提示ILAKFLHWL(540-548)和LLGASVLGL(675-683)肽与HLA-A*0201分子之间的结合较其他多肽稳固，查阅文献可知ILAKFLHWL(540-548)是已报道的表位外，余表位肽未见报道。 结论:表位预测数据库SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL及计算机分子模拟技术可快速有效地预测抗原表位，ILLGASVLGL(675-683)有可能是新发现的hTERT的HLA-A*0201 CTL表位，可用于后续研究。 研究二:hTERTHLA-A*0201限制性CTL表位的鉴定 目的:合成和鉴定hTERT HLA-A*0201限制性CTL，预测表位肽的亲和力，稳定性及免疫原性。 方法:标准Fmoc固相法合成6条预测的表位肽，高压液相射谱仪(HPLC)纯化分析，质谱法(MS)鉴定。T2细胞株测定各肽与HLA-A*0201分子的亲和力和稳定性。HLA基因分型技术PCR-SSO和PCR-SSP确定HLA-A*0201阳性个体。酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)技术检测HLA-A*0201+健康人对6条肽的T淋巴细胞反应，筛选出反应较强的肽段。 结果:标准Fmoc方案合成的各肽纯度均大于95％，质谱检测结果表明，各肽的相对分子质量与理论值基本一致。在6个候选表位肽中，ILAKFLHWL(540-548)和ILLGASVLGL(675-683)2个九肽与HLA-A*0201的亲合力较强，荧光系数（Flu-rorescene index，FI)分别为3.20和2.98，同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间（Dissociation complex50，DC50）均大于8h。从20名健康人筛选出2位HLA-A*0201+个体。ELISPOT技术显示ILAKFLHWL(540-548)和ILLGASVLGL(675-683)较其余4肽相比，可诱导较强的T淋巴细胞反应，T细胞频率分别为258±45和534±57 SFC/106 PBMC。 结论:ILAKFLHWL(540-548)和ILLGASVLGL(675-683)为潜在的HLA-A*0201限制性CTL表位。 研究三:健康人hTERT(675-683) LLGASVLGL特异性CTL克隆的诱导、鉴定及功能研究 目的:体外培养健康人的hTERT(675-683) LLGASVLGL特异性CTL克隆，并研究其生物学特性和功能。 方法:分离2AI HLA-A*0201健康人外周血单个核细胞，以60Co照射45Gy的同种异体PBMC作为饲养细胞，用细胞因子IL-2和相应的抗原多肽刺激培养，以有限稀释法分选的hTERT(675-683) LLGASVLGL特异性CTL克隆，后扩增培养。采用HLA-A2/多肽五聚体复合物即pentramer检测CTL细胞的纯度。建立顺铂耐药乳腺癌细胞株MCF-7/DDP，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测耐药指数。乳腺癌干细胞球悬浮培养于含EGF、bFGF的DMEM/F12无血清培养基中。用扩增后的CTL细胞与乳腺癌细胞系的MCF-7，顺铂耐药乳腺癌细胞系MCF-7/DDP和无血清培养获得的MCF-7乳腺癌干细胞球细胞按不同效靶比例孵育，用乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行细胞毒活性测定。流式细胞仪检测3种乳腺癌细胞系中乳腺癌肿瘤干细胞ESA+CD44+CD24-/low的比例，采用实时荧光定量(SYBR GreenRT-PCR)法检测hTERT mRNA在3种乳腺癌细胞系的表达。 结果:获得了1株特异性较高hTERT(675-683) LLGASVLGL的CTL细胞克隆，五聚体技术检测CTL克隆的纯度可达90.03％。MTT验表明，MCF-7/DDP对顺铂的耐受性(IC50为42.13μ g/ml)较亲代敏感株MCF-7(IC50为6.9μg/ml)增加了6.11倍。MCF-7、MCF-7/DDP和MCF-7干细胞球3种乳腺癌细胞中具有乳腺癌干细胞表型ESA+CD44+CD24-/low的细胞比例依次递增，分别为26.01％±0.57％,70.04％±1.03％，93.92％±0.98％，且荧光定量PCR的结果显示MCF-7/DDP及乳腺癌干细胞球的hTERTmRNA相对表达水平明显高于MCF-7。CTL细胞克隆对3三种乳腺癌细胞株均有着较强的细胞毒作用，且随着效靶比增高而有所增强。 结论:成功建立了健康人hTERT(675-683) LLGASVLGL特异性CTL克隆，该克隆对MCF-7、MCF-7/DDP和MCF-7干细胞球3种乳腺癌细胞均有较强的杀伤作用。