黑素瘤是侵袭性最大的皮肤肿瘤，对现有的抗癌化疗抵抗。在疾病的发展中，黑素瘤细胞通过内源性机制耐受凋亡，改变增殖和存活途径。目前医学界面临的问题是，找出新的治疗方案，改善晚期黑素瘤患者的预后。 砷剂的使用具有悠久的历史，20世纪中期，由于其难以接受的不良反应而废弃。三氧化二砷传统混合物的提纯，低剂量即对治疗APL有效。最近研究发现，三氧化二砷对很多肿瘤细胞，包括食道癌、胃癌、恶性淋巴样神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤等，均有促凋亡作用。到目前为止，三氧化二砷对恶性黑素瘤的作用，尚无研究。 白癜风是色素脱失过程，表皮的MC被破坏。表皮的复色常在毛囊口开始，这一临床现象提示毛囊内有未活化的MC或MC前体。毛囊MC从功能和形态上可分两类：一种是存在于毛漏斗和毛球部的色素性黑素细胞(树突状，DOPA染色阳性)，另一种是位于毛囊外根鞘中下部的无色素性黑素细胞(非树突状，DOPA染色阴性)。后者作为生长期早期毛球黑素细胞、斑秃中毛发再生、白癜风复色、烧伤和表皮擦伤后复色过程中黑素细胞储库。毛囊黑素细胞培养有利于明确毛囊黑素细胞在毛发生长和色素病发生、发展、转归中的作用。 南京医科大学博士学位论文 表皮黑素单位是一种功能单位，产生和分布黑素，由一个MC和大约36个KC构成。黑素体是MC特有的细胞器，功能是合成黑素，通过吸收和散发光线和减少活性氧簇的产生而起光防护作用。为完成这个功能，黑素体必须转运到KC。黑素体为卵圆形或类球形，含有黑素形成的酶和辅因子，包括酪氨酸酶基因家族的蛋白质，根据电子显微镜下形态和黑素化程度，将黑素体分为I一1V期。负载黑素的黑素体从MC的核周转运到树突，再到部近的KC，被分散到细胞质。黑素体转运到KC以及KC一MC的相互作用过程尚不清楚。本论文分为4个部分: 第一部分:黑素瘤Cloudman 591细胞凋亡的研究 在已知三氧化二砷诱导其他肿瘤细胞凋亡的基础上，本实验探讨其对恶性黑素瘤的治疗作用。恶性黑素瘤的发生率较其他恶性肿瘤发生率增加更快。顺铂是古老的有效的抗肿瘤药物，它可抑制肿瘤细胞的DNA合成，促进细胞凋亡。 在我们的研究中，Cl。udman 591黑素瘤细胞系来自患恶性黑素瘤的小鼠。MTT还原法检测As 20。或顺铂对591存活率的影响，A0染色观察凋亡细胞形态、流式细胞仪分析凋亡周期，末端脱氧核普转移酶(TdT)介导的脱氧尿普三磷酸(dUTP)末端标记法(TUNEL)原位观察，计算平均凋亡指数。DNA凝胶电泳研究基因组DNA。结果显示591细胞经3一5拼mol/L As203处理后，存活率降低，并与药物浓度正相关;荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞;细胞周期G1期前 南京医科大学博士学位论文出现凋亡峰;DNA凝胶电泳显示有规律的梯状条带。CDDP处理后，591存活率降低，并与药物浓度正相关;荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞;细胞周期Gl期前出现凋亡峰。DDP浓度在10、20、30林mol/L时，平均凋亡指数分别为n.5%、19.8%、33.7%o 第二部分:毛囊无色素性黑素细胞的分离培养 研究发现无色素性黑素细胞位于毛囊外根鞘的中下部，构成皮肤 黑素细胞的储库。在白瘫风的复色中，这些细胞被激活、增殖，并进 一步迁移到表皮，出现临床所见的毛囊周围点状复色。 无色素性黑素细胞是一小群可从毛囊中消化后游离出来的细胞， 体外培养中，增殖很慢，而且常被繁殖较快的成纤维细胞污染。这一 状况阻碍了无色素细胞的培养，妨碍了更好研究在毛发生长和色素性 疾病中这些细胞的作用。 在本研究中，首先，为了明确外毛根鞘细胞成分和无色素性黑素 细胞所处位置，我们将拔取的单个的生长期毛囊进行2%的琼脂预包 埋，7“m连续切片，分别用NKI/be teb和HMB一45单抗染色。另取毛 囊用胰酶消化，收集细胞，在电子显微镜下进行观察。结果显示:拔取的正常毛囊外根鞘中存在NKI/beteb阳性细胞，而HMB一45染色阴性。在毛母质中有大量的HMB一45阳性细胞。消化的细胞为有活性的MC、AMMC、毛皮质细胞和成纤维细胞。 第二，进行毛囊黑素细胞的分离和培养，探讨其生物学特性。采用胶原酶V游离毛囊;0.5%分离酶消化婴幼儿包皮。0.肠%胰酶/5 3fnM 南京医科大学博士学位论文EDTA消化游离的毛囊和来自包皮的表皮，分别制备单细胞悬液进行培养。培养基中添加TPA、CT和K一SFM，细胞传至第3代，待细胞爬上盖玻片后，分别以NKI/beteb和HMB一45单抗染色。结果显示:来自毛囊的培养细胞，去除污染的角质形成细胞，还有两种不同形态的细胞，大多数的为双极，增殖较快，能被NKI/beteb染色，而HMB一45单抗染色阴性，包皮的黑素细胞染色结果则与之相反。因此认为毛囊的外根鞘中存在功能和形态上不成熟的AMMC。AMMC长期培养的成功，有利于研究AMMC在毛囊生物学中所起的作用第三部分人表皮黑素细胞、毛囊无色素黑素细胞和鼠 黑素瘤细胞的原子力显微镜观察 黑素细胞是起源于神经岭，定植在表皮基底?